青春期双酚A暴露对小鼠社会行为的影响

摘要

社会行为主要包括社会性行为、社会等级、领域、通讯，通讯行为是其他行为进行的基础，而动物通讯行为中，社会交互行为是个体融入社会所需要的基本社会能力，也是理解人类行为动机的核心概念。玩耍是社会交互的有力形式，具有高度的奖赏作用，对个体生存技能的获得和紧急状况的灵活处理能力非常重要。玩耍在青春期达到高峰并随着年龄的增加逐渐降低，动物的行为具有明显的性别差异。青春期性腺开始发育，分泌性激素，调控脑的性别二态性和行为的性别分化。双酚A(Bisphenol A，BPA)兼有雌激素和抗雄激素活性，可影响性腺发育，从而干扰性激素的合成、分泌和功能，最终影响行为的发展。推测，青春期BPA可能通过对性激素的干扰影响小鼠的社会行为。
　　杏仁核和纹状体脑区是控制社会行为、情绪和认知行为的重要脑区，基底外侧杏仁核激活可巩固目标识别记忆，多巴胺(Dopamine，DA)递质系统在情绪和社会行为发展中发挥了重要的调控作用。DA可通过激活中脑腹侧被盖区-杏仁核-终纹床核-伏核这条奖赏环路来调控社会互作和其他形式的社会联系，纹状体DA的过度损耗，可引起社会玩耍结构的变化。若DA转运体（Dopamine transporter，DAT）被阻断，则DA的转运和重吸收受到影响，会引起突触间隙的多巴胺水平变化，干扰多巴胺的向后传递，从而影响社会玩耍。神经递质主要通过与其受体结合来发挥作用，DA与DR1型受体结合能对社会玩耍和社会交互行为产生调控作用，DR1被激活会抑制社会交互和社会玩耍的发生。研究发现，负性情绪较低的个体往往具有良好的社交关系状态，抑制性神经递质γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)参与情绪和社会行为的调控，应用GABAA受体阻断剂可加剧焦虑，而GABAA受体激动剂可起到抗焦虑作用。胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)在信号传导中处于关键地位，磷酸化激活的ERK1/2(Phosphorylation of ERK1/2，P-EK)由胞质转位到核内，通过级联反应作用于核转录因子，调控基因表达。因此，本研究进一步分析BPA是否会通过干扰ERK1/2的磷酸化调控核内基因的表达，从而影响社会行为相关脑区受体和转运蛋白的表达水平。
　　研究方法:
　　青春期4周龄雌、雄ICR小鼠分别暴露于BPA(0.04、0.4、4mg/kg/d)2.5周(PND28到PND45)，对照组经相同体积的溶媒处理。PND49开始进行行为检测(n=15)，利用三室模型检测小鼠的社会交互能力，社会玩耍模型检测小鼠的社会玩耍和社会探究能力，用旷场、高架十字迷宫模型检测小鼠的活动性和焦虑状态，用强迫游泳模型检测小鼠抑郁状态。同时，取未进行行为测试的小鼠酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测雌鼠血清和脑内的雌二醇水平以及雄鼠血清和脑内的睾酮水平(n=6);另用蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)检测与社会行为相关的纹状体和杏仁核脑区内性激素受体AR和Erβ，DA和GABA递质系统内DAT、DR1、GABAAR-2α，以及ERK1/2和P-ERK蛋白的表达水平(n=6)。
　　研究结果:
　　1、行为检测
　　(1)旷场行为检测发现，BPA暴露显著降低小鼠5min内的跑格数（4mg/kg/d,雌，P＜0.001;雄，P＜0.05）;显著降低小鼠悬空站立次数（雌，0.04、4mg/kg/d,P＜0.05，P＜0.05;雄，0.04～0.4mg/kg/d,P＜0.05，P＜0.01）;显著降低小鼠的理毛频率(雌，4mg/kg/d,P＜0.05;雄，0.4mg/kg/d，P＜0.05)。以上结果提示，BPA暴露降低小鼠的活动性，减弱小鼠对新异环境的探究意愿。
　　(2)社会玩耍实验中，BPA暴露显著减少雌鼠的社会探索时间和次数(4mg/kg/d,P＜0.01)以及社会玩耍次数(0.04mg/kg/d,P＜0.001)，并由此诱导雌性小于雄性的社会探索性别差异。
　　(3)在社会交互实验中，0.04～4mg/kg/d BPA显著缩短雄鼠在社会隔间/非社会隔间停留时间比值(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01);同时，0.04～4mg/kg/d BPA暴露显著缩短雄鼠嗅探陌生鼠/嗅探空滚筒的时间比值(P＜0.01），但对雌鼠以上两个指标没有显著影响。
　　(4)高架十字迷宫测试中，0.4～4mg/kg/d BPA暴露显著降低雌鼠开放臂停留时间(P＜0.001，P＜0.05)，0.04～4mg/kg/d BPA暴露降低中央区的探头次数(显著性水平均为P＜0.001)，但对雄鼠没有明显作用，提示BPA暴露抑制雌鼠的探究能力并加剧焦虑状态，与旷场行为检测结果一致。
　　(5)强迫游泳测试发现，BPA暴露显著延长小鼠6min后4min的静止不动时间(雌:4mg/kg/d,P＜0.05;雄:0.4mg/kg/d,P＜0.01)，显著缩短雄鼠静止不动的潜伏期(0.4mg/kg/d,P＜0.01)，提示BPA暴露加重雌、雄小鼠的抑郁状态。
　　2、性激素与生殖发育
　　ELISA测试结果显示，0.04和4mg/kg/d的BPA暴露显著降低雌鼠血清雌二醇水平(P＜0.01，P＜0.05)和雄鼠血清睾酮水平(P＜0.01），但对小鼠的脑内性激素水平没有显著影响。此外，BPA暴露对小鼠体重没有影响，但0.4～4mg/kg/d降低雄鼠的生殖器官系数(P＜0.05，P＜0.01)。
　　3、Western Blot分析
　　BPA暴露显著下调雌鼠纹状体脑区ERβ(0.04～4mg/kg/d,P＜0.05;4mg/kg/d，P＜0.01)和GABAAR-2α（均P＜0.001）蛋白表达，上调DAT(0.04mg/kg/d P＜0.01;0.4～4mg/kg/d P＜0.001)和DR1(4mg/kg/d,P＜0.05)蛋白表达;BPA显著上调雄鼠纹状体脑区AR(0.4mg/kg/d,P＜0.05;4mg/kg/d,P＜0.01)、DAT(0.4～4mg/kg/d,P＜0.001)、DR1(0.4mg/kg/d,P＜0.01;4mg/kg/d,P＜0.001)蛋白表达，显著下调GABAAR-2α（4mg/kg/d，P＜0.001）的表达。此外，BPA暴露不改变ERK1/2蛋白表达水平，但显著下调ERK1/2的蛋白磷酸化水平。BPA对杏仁核脑区以上各种蛋白表达水平的影响与纹状体呈现相似的趋势。
　　结论:
　　青春期BPA暴露可性别差异的影响小鼠社会行为和情绪，减弱小鼠的社会能力，加重小鼠的抑郁状态和雌鼠的焦虑状态。BPA可能通过降低体内性激素水平，并干扰性激素对ERKs信号通路的活性而调控社会行为相关脑区DA递质系统中DAT、DR1以及GABA递质受体GABAA-2α蛋白表达水平改变，最终负向调控社会行为和情绪。

目录

摘要

符号说明

第一章 绪论

1 BPA的毒性作用

2 社会行为及其重要性

3 性激素对社会行为的影响

4 多巴胺递质系统与社会行为的关系

5 研究目的及意义

第二章 青春期双酚A暴露对小鼠社会行为及情绪的影响

1 引言

2 材料

2．1 动物分组及处理

2．2 试剂及器材

2．3 动物染毒

2．4 行为学检测

2．5 数据统计分析

3 结果

3．1 旷场

3．2 社会行为

3．4 高架十字迷宫

3．5 强迫游泳

4 讨论

4．1 BPA暴露对社会行为的影响

4．2 BPA暴露对情绪的影响

第三章 青春期双酚A暴露对小鼠生殖发育的影响及脑内和血清激素水平的影响

1 引言

2 材料和方法

2．1 动物分组和处理

2．2 实验器材

2．3 生长发育指标及血清和脑内激素水平检测

2．4 数据统计分析

3 结果

3．1 BPA暴露对激素水平、生殖、生长发育的影响

4 讨论

4．2 BPA暴露对生殖发育指标和激素水平的影响

第四章 青春期双酚A对脑内多巴胺递质系统和脑内性激素受体水平的影响

2．1 动物分组和处理

2．2 实验试剂及器材

2．3 Western Blot检测

2．4 数据统计分析

3 结果

3．1 纹状体脑区的相关蛋白表达

3．2 杏仁核脑区的相关蛋白表达

3．3 细胞外信号调节激酶ERK1／2的表达

4 讨论

4．1 BPA暴露对多巴胺递质系统的影响

4．2 BPA暴露对性激素受体影响

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的研究成果

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