入侵生物李属坏死环斑病毒检测鉴定及多抗制备

摘要

李属坏死环斑病毒(Prunu.necroti.ringspo.virus，PNRSV)是我国农业和进境检疫性有害生物，可侵染多种果树、花卉及经济作物。浙江省是重要的核果类果树和花卉基地，对该病毒的发生危害等情况缺乏了解，而且目前国内对其进行检测用的PNRSV抗血清产品完全依赖进口。基于此，本研究从发病区北京、西安和昆明等地采集病叶进行分子和免疫检测的基础上，以樱桃、桃、月季等易感寄主植物大量集中种植的杭州周边地区为代表，取样调查该病毒在浙江省的发生情况；并以上述4省获得的不同分离株为材料，进行该病毒分子生态相关的鉴定分析，进而构建该病毒CP蛋白重组表达菌，纯化融合蛋白并制备了多克隆抗体，为建立分子与免疫学相结合的PNRSV的检测体系奠定基础。
　　 本研究采用DAS-ELISA和RT-PCR方法，检测了4个北京昌平和3个陕西西安的樱桃样品，3个云南昆明的月季样品，阳性检测率分别为25％、100％和66.7％。在此基础上，采用DAS-ELISA法对杭州周边地区包括杭州、诸暨、海宁的果木园林植物进行PNRSV的疫情调查，检测样品包括樱桃、桃、李和月季等共计96个，结果在海宁的10个样品上检测到PNRSV，检出率高达71.4％，田间发病率达19.5％，已严重威胁海宁花卉基地的生产安全。
　　 测定了北京、昆明、西安三个PNRSV分离物的CP基因，并测定了海宁分离物RNA3全长序列。北京分离物的CP基因为67.nt编码22.aa，海宁、昆明和西安分离物的CP基因均为68.nt编码22.aa。海宁PNRSV分离物RNA3全长195.nt，编码2个蛋白即85.nt的MP基因和68.nt的CP基因。其余各部分，5’-UTR含17.nt，3’-UTR含17.nt，基因间隔序列含7.nt。4个分离物CP基因之间具有很高的同源性，各个分离物间的核苷酸同源性在94.8％-99.3％之间，氨基酸同源性在94.2％-98.7％之间。CP基因核苷酸序列系统发生树(UPGMA法)结果表明，北京分离物属于Grou.II组，昆明、西安和海宁分离物属于Grou.I组。北京分离物与Grou.II组分离物的相似性高于98.2％，与Grou.I组和GroupⅢ组分离物相似性在88.9％-95.4％之间；昆明分离物与Grou.I组分离物的相似性高于96.8％，而与Grou.II组和GroupIII组分离物相似性在88.7％-95.4％之间；西安分离物与Grou.I组分离物的相似性高于97.2％，而与Grou.II组和Grou.III组分离物相似性在89.5％-96.1％之间；海宁分离物与Grou.I组分离物的相似性高于97.4％，而与Grou.II组和Grou.III组分离物相似性在89.2％-96.7％之间。对海宁分离物MP蛋白氨基酸序列的研究表明，海宁分离物属于CH9血清型。北京和西安分离物与CH9血清型温和型株系较接近，而昆明分离物的致病型尚无法确定。
　　 以pQE-30为质粒和大肠杆菌SG13009为宿主菌构建了PNRS.CP表达重组菌，得到了纯度大于95％的融合蛋白，并制备了多克隆抗体。经wester.blotting检测，多克隆抗体可以有效检测PNRSV，但是特异性不够理想，需要进一步纯化重组蛋白或制备单克隆抗体以增强其特异性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1 植物病毒检测方法概述

1.1 生物学鉴定

1.2 电镜观察

1.3 血清学检测

1.4 核酸检测

2 李属坏死环斑病毒概述

2.1 李属坏死环斑病毒生物学特性

2.2 李属坏死环斑病毒分子结构

2.3 李属坏死环斑病毒株系

2.4 李属坏死环斑病毒检测方法

3 本研究的目的和意义

第二章 试验材料和方法

1 试验材料

1.1 检测材料

1.2 试验试剂和菌种

1.3 主要仪器

2 试验方法

2.1 PNRSV的DAS-ELISA检测

2.2 PNRSV病样中植物总RNA的提取

2.3 PNRSV外壳蛋白基因的RT-PCR扩增

2.4 PCR产物回收纯化

2.5 PNRSV CP基因与克隆载体的连接反应

2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.7 连接产物转化感受态大肠杆菌细胞

2.8 重组质粒菌落PCR鉴定

2.9 碱裂解法提取质粒DNA

2.10 pQE-30-PNRSV CP重组表达质粒构建

2.11 重组表达质粒验证

2.12 重组质粒在大肠杆菌中表达

2.13 SDS-PAGE电泳分析

2.14 蛋白纯化

2.15 Western blotting检测

2.16 PNRSV RNA3全长扩增

第三章 结果与分析

1 PNRSV DAS-ELISA和RT-PCR检测结果

1.1 PNRSV的DAS-EIASA检测结果

1.2 PNRSV的RT-PCR检测结果

1.3 检测结果分析

2 CP基因重组克隆和测序

2.1 CP基因重组克隆菌落PCR验证

2.2 CP基因测序结果

2.3 PNRSV分离物CP基因分析

3 海宁分离物RNA3全长测序

3.1 各个部分扩增结果

3.2 重组克隆菌落PCR验证

3.3 全长测序结果

3.4 海宁分离物RNA3全长分析

4 PNRSV CP重组菌构建及表达纯化

4.1 PNRSV CP基因扩增

4.2 PNRSV CP重组菌验证

4.3 重组菌表达及纯化

4.4 Western blotting检测

4.5 结果分析

第四章 结论与总讨论

1 结论

2 总讨论

参考文献

致谢

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