麻疹病毒血凝素基因表达与抗原性鉴定

摘要

血凝素(hemagglutinin，HA)是位于麻疹病毒表面的II型跨膜糖蛋白，主要在麻疹病毒融合到宿主细胞的过程中发挥作用。血凝素能与宿主细胞表面的CD46和SLAM两大受体结合，并与病毒表面的融合蛋白(fusion，F)相互作用，诱导病毒包膜与细胞膜发生融合，此外血凝素一般情况下还具有凝集猴红细胞的作用，这一作用可能也与CD46受体结合有关。目前研究表明血凝素基因发生了变化导致出现抗原漂移，可能是麻疹疫情间歇的在局部区域爆发且发病率提高的原因之一。
　　 本文选用2005年浙江省流行毒株MVi/Zhejiang.CHN/7.05/4(该毒株已完成了全基因组测序工作，GenBank登录号为DQ211902)，由于HA含有跨膜区，在原核表达系统中跨膜区和信号肽的存在通常对重组蛋白表达不利，首先利用在线软件分别对信号肽和跨膜区进行预测，结果显示去除了信号肽和跨膜区的HA基因长度为1670bp，编码559个氨基酸，预测分子量约为62KDa。从该病毒株细胞培养液中提取总RNA，通过一步法RT-PCR扩增其血凝素基因，克隆入pGEM-Teasy载体，转化入E.col.DH5α，用Bam.I和HindIII双酶切鉴定重组子是正确的，双向测序确证无突变。进一步将HA基因亚克隆至pET28a(+)表达载体，转化BL21(DE3)，培养后，用终浓度为1mM的IPTG诱导重组菌表达。超声波破碎菌体后，利用SDS-PAGE分析HA基因表达情况，结果显示在62kDa处有一特异性条带与目的蛋白分子量相一致，且重组蛋白主要以包涵体形式存在，利用Wester.blot方法鉴定重组蛋白发现其抗原性良好。破碎菌体通过Ni-NTA树脂亲和层析纯化获得了的高纯度目的蛋白，采用Bradford方法测定蛋白的浓度为0.3512mg/ml。纯化的目的蛋白用于建立酶联免疫吸附反应，对人群血清标本进行麻疹病毒IgG抗体检测。实验结果证实重组蛋白具有较好的免疫原性。在本研究中我们成功构建了麻疹血凝素基因的表达载体并在大肠杆菌中进行了诱导表达，获得了抗原性良好的重组蛋白，并初步建立了利用重组HA检测麻疹病毒IgG的ELISA方法。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

第一章 文献综述

1.1 麻疹研究历史

1.2 麻疹病毒病原学

1.3 麻疹病毒的结构

1.3.1 麻疹病毒形态

1.3.2 麻疹病毒基因组结构

1.4 麻疹病毒感染过程

1.5 麻疹病毒主要蛋白

1.6 血凝素的结构与功能

1.6.1 血凝素的结构

1.6.2 血凝素的功能

1.6.3 血凝素受体

1.7 融合蛋白核蛋白和核蛋白

1.8 麻疹病毒检测

1.9 麻疹病毒基因组的变化

1.10 展望

第二章 实验方案设计

2.1 实验目的与意义

2.2 研究内容

2.3 实验流程图

第三章 麻疹病毒血凝素基因克隆

3.1.材料与试剂

3.1.1 材料

3.1.2 试剂

3.1.3 试剂配制

3.2 方法

3.2.1 重组表达质粒的构建策略

3.2.2 病毒总RNA提取

3.2.3 引物的设计

3.2.4 一步法RT-PCR扩增

3.2.5 RT-PCR产物切胶回收

3.2.6 连接反应

3.2.7 感受态细胞的制备

3.2.8 连接产物转化

3.2.9 重组克隆质粒的筛选与鉴定

3.2.10 重组表达质粒的构建及其筛选与鉴定

3.3 结果

3.3.1 麻疹HA信号肽和跨膜区的预测

3.3.2 MV-HA目的片段扩增

3.3.3 T-A克隆载体的鉴定

3.3.4 重组表达载体双酶切鉴定

3.4 讨论

第四章 重组麻疹血凝素的表达、鉴定与纯化

4.1 材料与试剂

4.1.1 材料

4.1.2 试剂

4.1.3 主要试剂配制

4.2 方法

4.2.1 重组质粒在大肠杆菌中表达

4.2.2 SDS-PAGE电泳分析重组蛋白表达情况

4.2.3 Western blot鉴定重组蛋白抗原性

4.2.4 NTA树脂纯化重组蛋白

4.2.5 Bradford法定量

4.3 结果

4.3.1 重组蛋白的诱导表达

4.3.2 重组蛋白的表达形式

4.3.3 Western blot鉴定血凝素表达

4.3.4 MV-HA重组蛋白的纯化

4.3.5 目的蛋白Bradford法定量

4.4 讨论

第五章 ELISA检测

5.1 材料与试剂

5.1.1 材料

5.1.2 试剂

5.1.3 ELISA溶液配制

5.2 重组蛋白ELISA检测人血清标本

5.2.1 ELISA方法建立

5.2.2 重组蛋白ELISA检测人群血清标本

5.3 结果

5.3.1 ELISA检测方法的建立

5.3.2 ELISA检测人群血清样本

5.4 讨论

结论

参考文献

致谢

附录 主要仪器

在学期间发表的论文