家蚕中孕酮受体膜元件2的(PGRMC2)的表达纯化及功能初步分析

摘要

在家蚕cDNA文库中筛选,经生物信息学分析发现其与家蚕孕酮受体膜元件2有100％的同源性,又经与SILKBase比对暂定这个序列是家蚕孕酮受体膜元件2,GenBank登陆号为DQ311390。该基因序列全长为772 bp,开放阅读框大小为681bp,该基因编码226个氨基酸残基,预测分子量大小为29.054 kD,等电点为5.67。根据PGRMC12基因的ORF框序列设计上下游引物,PCR扩增后产物经EcoR I和Xho I双酶切,并插入融合表达载体pET-28a的相应酶切位点,成功构建重组质粒并转化大肠杆菌Rosseta(DE3),经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。用浓度为1 mmol/L的IPTG诱导工程菌后,裂解菌体作SDS-PAGE分析,在29 kD左右的位置有一特异性蛋白条带,与预期值相符。重组蛋白以可溶的形式表达,利用亲和层析的方法纯化目的蛋白His-tag-PGRMC2,抗原免疫雄性新西兰兔,制备了该重组蛋白的多克隆抗体。多克隆抗体经Protein A凝胶柱纯化,ELISA检测抗血清的效价可达到1:25600以上。我们利用荧光定量PCR的方法,对家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个发育时期,以及五龄幼虫各组织中的mRNA进行转录水平分析,实验结果表明目的蛋白在蛹期和生殖腺、丝腺中表达量较高。提取家蚕五龄幼虫的各组织蛋白,用于Western blotting实验,实验结果表明PGRMC2蛋白在家蚕的卵、五龄幼虫、蛹期和生殖腺、表皮、脂肪体中均有表达,且随着家蚕的发育PGRMC2蛋白的表达量增加,五龄幼虫中生殖腺中含量最高。以家蚕BmN细胞进行免疫细胞化学实验,结果显示,PGRMC2蛋白主要分布在细胞质和细胞膜上,少量分布在细胞核内。以上这些结果为深入研究PGRMC2蛋白奠定了基础。