纳米磷酸钙在可注射组织工程骨中的应用研究

摘要

随着人口老龄化现象的加剧和交通/运动创伤的增加，人们对骨移植材料的需求也日益增多。利用组织工程骨来实现硬组织的修复替代正成为本领域一种最为理想的治疗手段。从临床角度来看，可注射组织工程骨的使用减少了患者的痛苦，避免了手术感染的风险，不易留疤且缩减了治疗的费用，因而受到越来越多地重视。
　　 本文以温敏性壳聚糖水凝胶为流动相，以纳米磷酸钙颗粒(nCP)为药物载体，以骨髓间充质干细胞(MSCs)为种子细胞，构建可注射组织工程骨，利用纳米磷酸钙颗粒优异的吸附和载药性能实现对药物和生长因子的可控释放，进而促进可注射组织工程骨对骨缺损的治疗和修复。具体研究内容和结果如下:
　　 1.利用化学共沉淀方法制备了纳米磷酸钙颗粒，并对其形貌、结晶度和孔隙率等性能进行表征。通过原核表达制备了人重组骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)，并利用所制备的颗粒为载体负载了rhBMP-2和地塞米松(Dex)，研究了药物负载量、释放速度及周期。结果表明:所制备的nCP颗粒呈均匀球状，结晶性较好，平均粒径为56.2±5.8nm，平均孔径为11.96nm，孔隙率和比表面积分别达到47.2％和89.337m2/g，有利于后续实验药物的负载及释放;rhBMP-2基因可在大肠杆菌BL21中成功表达，纯化后蛋白产量为27mg每升培养基，尿素梯度透析复性产率为35.9％;每50mg颗粒上rhBMP-2的负载率为56.1±0.493％，Dex的负载率为12.8±0.372％，负载的Dex和rhBMP-2可以较缓慢的速度持续释放半个月左右，证明nCP是较理想的药物载体，满足骨组织工程的应用要求。
　　 2.制备了壳聚糖/β-甘油磷酸钠/纳米磷酸钙(CS/GP/nCP)水凝胶，对水凝胶的凝胶时间、形貌、低温下的储存性能进行了表征。结果表明，随着GP浓度的提高，CS/GP/nCP体系的pH随之增高，凝胶时间逐渐变短，4℃下保持液态的时间更长。CS/GP/nCP水凝胶呈连续多孔的海绵状结构，孔径在100μm左右，适宜细胞的增殖，以及营养物质和生长因子的传递和运输。
　　 3.成功地提取大鼠的骨髓间充质干细胞，并与CS/GP/nCP水凝胶和载药nCP颗粒复合构建可注射组织工程骨，对其生物相容性进行表征。结果表明制备的可注射组织工程骨材料具有良好的生物相容性，MSCs能够在材料中正常增殖。当CS/GP/nCP体系中的Dex浓度为10-9M左右时，对MSCs的增殖有一定的促进作用;当Dex浓度过高时，会抑制MSCs的增殖。当rhBMP-2的浓度达到30μg/mL时，对体系中MSCs的成骨分化有显著的促进作用。Dex和rhBMP-2共同作用时，相对于不含药物或仅含单种药物的体系，CS/GP/nCP凝胶中的MSCs的增殖速度更快，且促成骨分化的效果更显著。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 组织工程概述

1．3 组织工程用水凝胶

1．3．1 天然水凝胶

1．3．2 合成水凝胶

1．3．3 可注射性水凝胶

1．3．4 水凝胶在组织工程中的应用

1．4 种子细胞

1．5 生长因子

1．6 纳米磷酸钙的应用

1．6．1 纳米磷酸钙在药物载体中的应用

1．6．2 纳米磷酸钙在肿瘤领域中的应用

1．6．3 纳米磷酸钙在骨组织工程中的应用

1．7 本课题的研究目的与意义

1．8 研究内容与创新点

第二章 纳米磷酸钙的制备及其性能表征

2．1 引言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器

2．2．3 实验试剂配制

2．3 实验方法

2．3．1 纳米磷酸钙的制备

2．3．2 纳米磷酸钙的表征

2．3．3 rhBMP-2的表达、纯化及复性

2．3．4 地塞米松(Dex)／rhBMP-2在纳米磷酸钙上的负载及释放

2．4 结果与讨论

2．4．1 纳米磷酸钙的表征

2．4．2 rhBMP-2的表达、纯化和复性结果

2．4．3 Dex／rhBMP-2在nCP颗粒上的负载及释放

2．5 小结

第三章 壳聚糖水凝胶的制备及其性能表征

3．1 引言

3．2 实验材料与仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验仪器

3．2．3 实验试剂配制

3．3 实验方法

3．3．1 壳聚糖水凝胶的制备

3．3．2 37℃下凝胶时间的确定

3．3．3 低温下储存时间的确定

3．3．4 水凝胶的形貌表征(SEM)

3．4 结果与讨论

3．4．1 CS／GP／nCP水凝胶

3．4．2 37℃下凝胶时间的确定

3．4．3 低温下的储存性能

3．4．4 水凝胶的微观结构

3．5 小结

第四章 可注射组织工程骨的生物相容性探索

4．1 引言

4．2 实验材料与仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验仪器

4．2．3 实验试剂配制

4．3 实验方法

4．3．1 大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的提取

4．3．2 大鼠骨髓间充质干细胞的传代培养

4．3．3 无菌水凝胶支架材料的制备与细胞接种

4．3．4 水凝胶支架材料的生物相容性测试

4．4 结果与讨论

4．4．1 大鼠骨髓间充质干细胞形态学观察

4．4．2 水凝胶的生物相容性

4．5 小结

第五章 结论

参考文献

攻读硕士期间发表的论文

致谢