转基因番茄外源基因检测方法研究

摘要

近年来，转基因技术的发展引起了人们关注。转基因技术为解决人类的食物短缺等问题带来了福音，然而其引发的合理性和安全性问题亦成为关注的焦点。针对转基因植株的安全性和合理性，建立健全转基因作物的检测方法体系显得很迫切，尤其是探索一套经济便捷的检测体系更是当前科研工作的重点。自第一例转基因植株培育成功以来，转基因作物种类不断增多，番茄作为世界性的蔬菜，针对其性状和质量改良的转基因品系也相继商品化进入市场。我国是番茄进出口大国，所以针对转基因番茄建立一套番茄转基因检测方法体系是有必要的。
　　 本文以两个阳性样品华番一号和丽春番茄，阴性对照样品合作903和一个购自市场的随机抽检样品为检测对象，分别采用传统定性PCR技术、核酸斑点杂交以及微流体芯片技术，对上述样品进行了检测。检测的外源基因选择转基因番茄中惯用的35S（花椰菜花叶病毒启动子）、NOS（胭脂碱合成酶终止子），NPTⅡ(新霉素转移酶基因)，35S-EFE(35S和番茄EFE基因的交联结构)、内参基因选择番茄Lat52（花药特异表达启动子），mcpi（金属羧肽酶），fru（β-呋喃果糖苷酶），apx（抗坏血酸过氧化物酶）。
　　 研究中首先采用传统定性PCR技术和核酸斑点杂交技术，检测了外源基因35S、NOS、NPTⅡ、35S-EFE和内参Lat52基因。选用质粒PBI121为阳性对照、合作903番茄为阴性对照。华蕃一号样品中4个外源基因和1个内参基因均成功检出，阳性质粒PBI121中只有35S、NOS、NPTⅡ基因被检出，阴性对照番茄合作903中只有内参基因Lat52检出。试验重复性良好，检测灵敏度高，两种方法相互补充，排除假阳性可能。核酸斑点杂交一次可检出多个外源基因，增加了检测数量，为我国番茄转基因检测提供参考。
　　 其次本研究将普遍运用于基因表达谱分析等领域的微流体基因芯片技术运用于转基因番茄检测，搜索报道的转基因番茄基因信息，设计了895条针对转基因番茄的外源基因和内参基因的寡聚核苷酸探针，每条探针4个重复，原位合成转基因番茄微流体检测芯片。分别采用普通PCR-CY3标记、（二次扩增）多重PCR-CY3标记和随机引物-CY3标记三种CY3标记方案将荧光信号渗入番茄DNA，以华番一号为样本进行芯片杂交检测，比较了三种标记方案的标记效果。选取标记效果较好的普通PCR-CY3标记和多重PCR-CY3标记方法分别对阳性品种丽春番茄进行芯片检测试验。并用普通PCR-CY3标记的方法检测了阴性番茄品种合作903以及随机抽检的市场品种黄色圣女果番茄。芯片检测结果表明:普通PCR-CY3标记、（二次扩增）多重PCR-CY3标记体系较适合芯片检测样品处理，而随机引物标记方法没得到较好的标记效果。从华番一号、丽春番茄样品中检出了35S启动子、NOS终止子、35S-EFE交联结构基因、NPTⅡ标记基因以及番茄的4个内参基因fru、apxmcpi、Lat52的多数探针信号，四次重复平均信号值良好，偏差小，信号值较高。合作903番茄的芯片上只有内参基因探针检出信号，而圣女果番茄中不仅检测到番茄内参基因探针信号，4个外源基因的探针均有探针信号检出。检测结果显示市购的黄色圣女果为转基因阳性样品，也有可能是圣女果番茄与转基因番茄间的基因漂移因素或者某些病毒或细菌的感染使其检测结果呈阳性。

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课题来源

摘要

缩略词

第一章 绪论

1 转基因技术发展及其转基因作物研究现状

1．1 转基因技术的发展

1．2 转基因作物研究现状

1．3 转基因作物的安全性评价

1．4 转基因植物的外源基因检测方法研究

1．5 转基因番茄研究现状及其检测方法

1．6 本研究的主要内容和意义

第二章 定性PCR技术和核酸斑点杂交检测转基因番茄研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 样品DNA提取结果

2．2 引物筛选结果

2．3 定性PCR检测结果

2．3 核酸斑点杂交检测结果

3 讨论与结论

3．1 PCR扩增引物的筛选

3．2 用Hot-star DNA聚合酶的影响

3．3 核酸斑点杂交的注意事项

3．4 结论

3．5 展望

第三章 用微流体芯片技术检测番茄外源基因成分研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果分析

2．1 样品DNA的提取结果

2．2 用于芯片杂交样品制备的引物设计结果

2．3 原位合成芯片探针及和芯片合成

2．4 样品中的荧光渗入情况

2．5 芯片杂交结果分析

3 讨论

总结

参考文献

附录：重要溶液配制

致谢

攻读硕士研究生期间的研究成果