携带ING4和GMCSF的双基因溶瘤痘苗病毒体外治疗癌症的研究

摘要

随着空气污染加剧促使环境的不断恶化，以及饮食、压力等多方面对机体的威胁，现在，癌症已经成为人类的头号杀手，是威胁人类健康的最主要疾病。由于治疗癌症的传统疗法受到多种原因限制，治疗效果并不理想并且毒副作用明显。随着医学科技的发展，治疗癌症的手段不断探索与更新，肿瘤的生物学疗法给患者带来了曙光。
　　结合基因治疗和病毒治疗两种癌症疗法的优势而提出的“癌症的靶向基因-病毒治疗”策略对选择病毒载体和治疗基因的活性提出了新的靶标。基于此策略，我们利用安全性高、复制快和包装容量大等特点的痘苗病毒携带ING4和GM-CSF构建了一种新的癌症靶向基因-病毒。已知，ING4基因广泛参与肿瘤的发生发展过程，其抑癌功能包括抑制HIF-1的活性、增强P53基因的活性，从而促进肿瘤细胞死亡；GM-CSF是一种粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，能够激活机体的免疫系统来增强抗肿瘤效果。
　　本研究以痘苗病毒为载体，使其携带ING4或GM-CSF两个治疗基因，从而包装出安全性高且杀伤效果显著的单基因溶瘤痘苗病毒OncoPox-ING4和OncoPox-GMCSF。重组痘苗病毒的构建将ING4和GMCSF两个基因插入到痘苗病毒pCB质粒载体的TK区，随后病毒和质粒在细胞内发生同源重组，目的基因将会插入到野生型痘苗病毒基因组，从而获得携带有双基因的OncoPox-ING4和OncoPox-GMCSF溶瘤痘苗病毒。
　　构建的重组痘苗病毒OncoPox-ING4和OncoPox-GMCSF经大量扩增、纯化和滴度测定后感染细胞，经Western blot检测出有目的基因的蛋白表达。接着用重组痘苗病毒来杀伤肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌和脑胶质瘤等细胞，通过观察细胞的形态学变化、结晶紫染色分析病理学效应、Hoechst检测凋亡诱导作用、MTT试验检测细胞的存活率以及Western Blot检测相关蛋白的表达，结果表明溶瘤痘病毒OncoPox-ING4对几种癌细胞的诱导凋亡效果最显著，同时也验证了其可能是通过抑制NF-kB信号通路中的某一个环节来抑制肿瘤生长。因此，痘病毒OncoPox-ING4对杀伤癌细胞具有广谱性且抗癌作用显著，验证了“靶向基因病毒治疗策略”的合理性，为治疗癌症提供了新的方法。
　　目前，溶瘤腺病毒用于治疗癌症是一个热点。本课题研究目的是检测溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac联合SNS-032治疗胰腺癌的协同作用。体外试验表明了SNS-032能够增强ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌的杀伤，诱导胰腺癌细胞的凋亡。Western blot试验表明SNS-032通过影响抗凋亡蛋白如CDK-2、CDK-9、Mcl-1、XIAP和Bcl-2等增强溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌细胞凋亡作用。体内试验也证明了SNS-032能够促进ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌的杀伤。本研究分别通过体内和体外试验证明，SNS-032能够加强溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌的杀伤，使其凋亡。试验数据表明，联合SNS-032和ZD55-TRAIL-IETD-Smac对于胰腺癌是个合理的治疗方法。

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第一章 携带ING4和GM-CSF双基因的溶瘤痘病毒体外治疗癌症的研究

1.1 引言

1.1.1 癌症治疗的研究现状

1.1.2 癌症的基因治疗

1.1.3 癌症的靶向-基因病毒治疗

1.1.4 痘苗病毒包装的介绍

1.2 试验材料与方法

1.2.1 试验材料

1.2.2 试验方法

1.3 试验结果

1.3.1 重组痘苗病毒目的基因的鉴定

1.3.2 重组痘苗病毒目的基因和野毒的鉴定

1.3.3 蛋白水平鉴定溶瘤痘苗病毒OncoPox-ING4和OncoPox-GMCSF的蛋白表达

1.3.4 细胞形态学观察

1.3.5 结晶紫染色分析重组痘苗病毒对PANC-1细胞的病理学效应

1.3.6 Hoechst33342检测重组溶瘤痘苗病毒对BxPC-3的凋亡诱导作用

1. 3. 7 MTT法检测重组痘病毒对癌细胞的杀伤效果

1.3.8 Western Blot分析表明溶瘤痘病毒OncoPox-ING4可能通过抑制NF-kB信号通路抑制肿瘤生长

1.4 讨论

1.5 结论

第二章 CDK抑制剂SNS-032联合溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac协同抑制胰腺癌的研究

2.1 引言

2.2 试验材料

2.2.1 细胞和试剂

2.2.2 病毒

2. 3 试验方法

2.3.1 腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac的大量纯化及病毒滴度测定

2.3.2 MTT检测细胞存活率

2.3.3 Hoechst3334染色观察肿瘤细胞的凋亡

2.3.4 流式分析细胞凋亡

2.3.5 Western blot分析

2.3.6 动物试验

2.3.7 统计分析

2.4 试验结果

2.4.1 SNS-032增强溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌的生长抑制

2.4.2 SNS-032增强ZD55-TRAIL-IETD-Smac诱导的胰腺癌细胞凋亡

2.4.3 SNS-032联合ZD55-TRAIL-IETD-Smac 对胰腺癌细胞凋亡有协同作用

2.4.4 SNS-032协同ZD55-TRAIL-IETD-Smac体内抑制胰腺癌细胞的增殖

2.4.5 SNS-032协同ZD55-TRAIL-IETD-Smac 体内抗癌效果显著

2.5 讨论

2.6 结论

参考文献

研究生期间的研究成果

致谢