菲降解细菌的分离鉴定及其降解效果的研究

摘要

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbon,PAHs)在环境中分布十分广泛，极易在环境中累积并可通过食物链传递，对人类健康和生态环境具有很大危害性。菲因具有独特的化学结构，成为PAHs研究的模式化合物，菲污染的研究不仅有利于污染环境中菲的去除，还可为其它PAHs污染的防治提供有价值的资料。 本研究利用选择性富集培养，从受污染土壤中分离到三株菲降解细菌，命名为C22，C13，C8；应用形态观察以及分子生物学手段相结合的方法对三株菌进行鉴定，菌株C22，C13，C8分别被初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，贪铜菌属(Cupriavidus sp.)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)；实验中利用高效液相色谱法(HPLC)测定显示三株细菌在液体培养条件下都表现出较强降解菲的能力，通过测定液体培养基中菲浓度和菌体密度变化，发现菌株降解菲的量与其生长密度相关，随着菌体浓度(OD)的增加，代谢底物菲的浓度明显降低；菌株混合使用能够大幅度提高菲的降解能力；菌株C22具有良好的pH和菲含量适应性，初始pH8.0更有利于菌株的生长和菲的彻底降解；有机物酵母膏、葡萄糖的加入可以不同程度加快菌株C22对菲的降解：Tween-80的加入也对菲降解效率有显著促进作用；与菲的单基质培养相比，多环芳烃萘、菲的共基质培养也促进了C22菌株对菲的降解；酶活测定实验显示菌株C22具有PAHs诱导的邻苯二酚2，3-双加氧酶(C230)活性；底物实验结果和降解酶活性测定表明，菌株C22可能通过水杨酸途径来降解菲；采用特异性引物，扩增菌株C22的C230编码基因全序列。

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第一章 绪论

1.1 PAHs及其污染现状

1.2多环芳烃来源

1.3 PAHs的生物毒性

1.4多环芳烃污染去除方式

1.4.1非生物消除

1.4.2生物降解和非生物处理相结合--复合修复

1.5多环芳烃降解分子机理

1.5.1染色体编码代谢途径

1.5.2降解质粒编码代谢途径

1.5.3质粒和染色体共同编码代谢途径

1.6 菲

1.6.1菲的结构特性

1.6.2菲的生物降解

1.6.3提供共代谢底物对菲降解率的影响

1.6.4细菌菲降解途径中的酶系

1.7本论文的研究内容、目的和意义

1.7.1主要研究内容

1.7.2研究目的和意义

第二章 菲降解菌株的分离筛选及其特性研究

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1试剂和仪器

2.2.2采样

2.2.3材料与培养基

2.2.4实验方法

2.3结果与分析

2.3.1筛选菌株降解效率的比较

2.3.2优势降解菌株菲降解曲线

2.3.3优势降解菌株生长曲线

2.4小结

第三章 三株优势降解菌株的鉴定及系统发育分析

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1试剂和仪器

3.2.2培养基及培养方法

3.2.3实验方法

3.3结果与分析

3.3.1菌株C22、C13、C8形态观察

3.3.2 16SrDNA扩增及测序

3.3.3基于16SrDNA序列系统发育树的构建

3.4小结

第四章 菲降解菌株生长和降解特性研究

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1试剂和仪器

4.2.2材料与培养基

4.2.3多环芳烃的测定方法

4.2.4菲降解生长菌株生长条件的研究

4.2.5菌株C22的菲降解特性研究

4.3结果与分析

4.3.1菲降解菌株生长条件

4.3.2菌株C22的菲降解特性

4.4小结

第五章 C22中邻苯二酚2，3-双加氧酶基因定位的初步研究

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1材料

5.2.2菌株C22代谢菲途径分析

5.2.3降解途径中相关酶的酶活测定

5.2.4 SDS法消除质粒

5.2.5引物设计

5.2.6总DNA提取

5.2.7质粒提取

5.2.8 PCR扩增及扩增产物的纯化

5.3结果与分析

5.3.1菌株C22代谢菲途径分析

5.3.2多酚氧化酶活性研究

5.3.3质粒消除实验结果

5.3.4邻苯二酚2，3-双加氧酶基因片段扩增及电泳检测

5.4小结

第六章 结论与建议

6.1实验结论

6.2建议

参考文献

致谢

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