活性分子定点识别技术筛选海洋真菌次级代谢产物的研究

摘要

本研究设计了一种双模型活性分子定点识别技术，利用HPLC图谱与活性识别谱一一对应即可起到生物活性分子测定定点分离的作用，以此筛选海洋真菌代谢产物中的活性成分。本文得出如下几点主要结论：
　　 （1）将分离自中国东海海域海水样品中的一株海洋真菌编号为ENP701＃作为实验研究对象，根据形态学评估初步鉴定其为青霉属真菌（Penicillium sp.），并将其大规模培养分离制备菌体和发酵液提取物浸膏。
　　 （2）采用GC-MS联用仪对不同培养时间的海洋真菌ENP701＃发酵液提取样品的挥发性成分进行分析，结果显示主要有芳香族、长链烷烃、生物碱、香豆素和酯类等化合物且不同培养时间下挥发性成分组成和含量不尽相同。
　　 （3）建立海洋真菌ENP701＃菌体和发酵液的双模型活性分子定点识别谱图，以此筛选其中的生物活性分子，为后续活性分子的定点分离纯化作参考。在建立抗肿瘤活性分子定点识别谱中，采用H460、PC-12、A549、3T3、HT1080和Hela等6株肿瘤细胞进行筛选，抗氧化活性分子定点识别谱建立在清除自由基DPPH的模型基础上。最终以抗H460肿瘤活性分子定点识别谱为主，抗氧化活性分子定点识别谱为辅建立了菌体和发酵液浸膏的双模型活性分子定点识别谱。
　　 （4）基于已建立的双模型分子定点识别谱，根据确定的最佳HPLC条件，采用中压制备仪直接进行菌体和发酵液浸膏中目标微量分子的定点分离，最终从菌体浸膏中分离到化合物1-6，分别为硫酸酯胆碱（1）、己六醇（2）、丁四醇（3）、喹啉生物碱的二聚物盐（4）、5，7，22-三烯-3β-羟基-麦角甾（5）、硬脂酸（6）。化合物4为新化合物，其对肿瘤细胞H460显示了明显的抑制活性，其IC50值为19.38±0.15μg·mL-1。此外化合物1-6均显示了清除自由基DPPH的活性，说明化合物1-6均有不同程度的抗氧化活性。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

论文中术语、缩略语一览表

第一章 绪论

1.1 海洋微生物研究的背景和意义

1.2 海洋真菌活性代谢产物研究进展

1.2.1 萜类

1.2.2 生物碱类

1.2.3 醌类

1.2.4 甾体类

1.2.5 香豆素类

1.2.6 肽类

1.2.7 抗生素类

1.3 高通量药物筛选技术

1.3.1 药物筛选模型

1.3.2 微生物药物的高通量筛选

1.4 本课题立题背景、意义

1.5 本课题研究内容

第二章 海洋真菌ENP701#的培养和菌种鉴定

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 五株海洋真菌的复苏

2.2.3 海洋真菌ENP701#的大规模培养及提取物制备

2.3 结果与讨论

2.3.1 海洋真菌ENP701#的形态

2.3.2 海洋真菌ENP701#的鉴定

2.3.3 提取物薄层色谱层析（TLC）

2.3.4 生物碱成分检测

2.4 本章小结

第三章 不同培养时间海洋来源真菌ENP701#挥发性成分分析

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 菌种培养

3.2.3 提取和分离

3.2.4 气相色谱-质谱联用（GC-MS）

3.3 结果与讨论

3.3.1 不同培养时间挥发性成分的定性分析

3.3.2 不同培养时间挥发性成分的定量分析

3.3.3 不同培养时间挥发性成分比较与分析

3.4 本章小结

第四章 海洋真菌ENP701#菌体和发酵液浸膏活性分子定点识别谱的建立

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 高效液相色谱（HPLC）条件的确定

4.2.3 HPLC-DPPH联用

4.2.4 HPLC-MTT联用

4.3 结果与讨论

4.3.1 菌体浸膏双模型活性分子定点识别谱的建立

4.3.2 发酵液浸膏双模型活性分子定点识别谱的建立

4.4 本章小结

第五章 海洋真菌ENP701#菌体和发酵液中活性微量次级代谢产物的定点分离和鉴定及其生物活性的测定

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 实验材料

5.2.2 活性分子定点识别技术筛选海洋真菌菌体浸膏次级代谢产物

5.2.3 活性分子定点识别技术筛选海洋真菌发酵液浸膏次级代谢产物

5.2.4 结构鉴定

5.2.5 DPPH自由基清除活性测定

5.2.6 羟基自由基清除活性测定

5.2.7 脂质过氧化抑制测定

5.2.8 肿瘤细胞生长抑制活性测定

5.3 结果与讨论

5.3.1 活性分子定点识别技术筛选海洋真菌菌体浸膏次级代谢产物

5.3.2 活性分子定点识别技术筛选海洋真菌发酵液浸膏次级代谢产物

5.3.3 结构鉴定

5.3.4 化合物的生物活性

5.4 本章小结

第六章 结论与展望

6.1 结论

6.2 创新点

6.3 展望

参考文献

附录

致 射

攻读硕士学位期间发表论文情况