高通量筛选评价典型环境内分泌干扰物细胞毒性及其雌激素效应

摘要

随着人类工业化进程的不断推进,大量化学物质在环境中不合理释放,目前,全球已知的化学品有700万之多,进入环境并日常接触使用的已达数十万余种,已经发现和确认多种化合物属于内分泌干扰物。这些化学品进入环境后,可模拟或抑制内源性激素的生物效应,改变信号传递过程,干扰内源性激素的产生从而造成内分泌功能紊乱。近年来,有关环境内分泌干扰物的研究己越来越受到各国的广泛关注。发达国家以巨大的投入在研究环境激素的种类、污染途径、主要污染源、生态危害、分子作用机理、污染控制和防治对策方面进行了大量的工作。美国EPA和NIH于1998年8月开始实施内分泌干扰物筛选计划,日本环境厅发表“环境类激素战略规划公告”,于1999年正式启动了环境类激素筛选计划。欧洲各国普遍建立政府行为的研究中心,实施环境激素的研究计划。据估计,发达国家在环境激素的研究方面已经投入了数十亿美元。可是由于评价体系复杂,试验周期长,且花费巨大,还有相当一部分化合物缺少必要的环境行为和毒理学数据,因此建立高通量筛选评价潜在环境内分泌干扰物毒理学效应的方法已是现阶段当务之急。
　　 在本研究中,我们进行了三方面的工作。首先通过化学光谱法高通量筛选了与遗传信息载体DNA有相互作用的,具有潜在细胞毒性的化合物,并在免疫细胞RAW264.7和神经细胞PC12体外细胞模型上,对其与细胞核DNA的相互作用和细胞毒性机理进行了研究;第二部分,采用了计算机分子模拟方法对一系列潜在的环境内分泌干扰物进行了类雌激素效应的高通量筛选,同时在人工重组转基因酵母系统中对雌激素活性进行了高通量评价和验证。最后我们选择具有典型雌激素效应的手性有机氯农药三氯杀虫酯,结合计算机模拟技术在两种不同的细胞模型中对其类雌激素效应和对生殖健康潜在影响的分子机理进行了研究,结论如下:
　　 1.紫外光谱法结果显示,功夫菊酯(lambda-cyhalothrin,λ-LCT)与小牛胸腺DNA(ctDNA)相互作用最为明显。RAW264.7细胞毒性实验的结果表明:λ-LCT对小鼠巨噬细胞具有显著的细胞毒性,其细胞毒性可能与λ-LCT介导的氧化应激和DNA损伤有关。
　　 2.荧光光谱法筛选了16种农药对DNA-EB荧光强度的影响,结果显示联吡啶类除草剂敌草快(diquat,DQ)能够诱导DNA-EB体系发生荧光淬灭,因此选择DQ作为目标化合物,对其在PC-12细胞上的细胞毒性进行评价。结果表明:DQ对PC-12细胞具有明显的毒性,呈现剂量-效应关系,并可以导致细胞核染色质凝聚。我们认为DQ与DNA通过静电相互作用是其潜在的细胞毒性的一个可能原因。
　　 3.我们通过人工重组转基因酵母对多种菊酯类农药的雌激素效应的对映体选择性进行了高通量评价,结果表明,其中三种cis-联苯菊酯(Cis-bifenthrin,Cis-BF)、氯菊酯(Permethrin,PM)和氰戊菊酯(Fenvalerate,Fen)具有明显的雌激素活性对映体选择性。Cis-BF的潜在雌激素效应能力大小顺序为:1S-cis-BF＞cis-BF＞1R-cis-BF。PM和Fen的外消旋体在转基因酵母系统中均未表现出明显的雌激素效应,但它们的两个对映体均能诱导报告基因的表达。分子对接技术为我们提供了一种有关研究手性配体与受体之间选择性结合而引起对映体选择的生物学差异的新方法。
　　 4.通过Molegro Virtual Docker(MVD)对接软件筛选24种多氯联苯(polychlorinated biphenyls,PCBs),随后运用转入人雌激素受体α(human Estrogen receptor alpha,hERα)基因的工程酵母进一步评价18种多氯联苯的雌激素效应,其中15种均具有不同程度的雌激素效应。分子对接初筛结果的准确率达到了50％以上,这为今后采用基于分子对接的高通量筛选方法,对大规模数据库化合物与靶标间的相互作用进行计算模拟奠定了基础,可以很大程度上实现快速检测确定优先污染物的目标;同时也将有助于今后分子间相互作用的机理研究。
　　 5.我们以三氯杀虫酯(Acetofenate,AF)为模式化合物,对其在MCF-7和JEG-3两种体外模型中的雌激素效应对映体选择性及其内分泌干扰机制进行了深入探讨。AF潜在雌激素效应的顺序为S-(+)-AF＞rac-AF＞R-(-)-AF。在滋养层细胞中,AF干扰的滋养层细胞激素分泌平衡和影响类固醇合成相关基因表达同样具有对映体选择性。这一研究首次就手性内分泌干扰物的母胎健康的对映体选择性差异进行了报道,为评价手性化合物的健康风险提供技术支持。