海洋真菌Alternaria sp.MNP801的HPLC-UV-ELSD筛选化学成分的研究

摘要

在药物先导化合物的筛选研究中，高通量筛选发挥着不可忽略的作用，但从含有复杂微量的天然代谢产物中分离筛选有明显生物活性、结构新颖的活性化合物非常受限。在课题组以往设计的生物活性导向高通量筛选方法，建立紫外分析液相色谱图（HPLC-UV）和抗肿瘤(MTT)、抗氧化(DPPH)、抗胰蛋白酶等生物活性相对应的导向分离图谱基础上，创新性的利用紫外-蒸发光液相谱图(HPLC-UV-EL SD)给出海洋真菌微量代谢产物HPLC-UV-ELSD谱的同时，利用抗氧化和抗肿瘤双模型生物活性谱导向筛选活性代谢产物，实现后续利用制备色谱柱直接分离活性代谢产物，有效的避免了无紫外吸收微量成分遗失的现象。
　　该筛选方法成功应用于海洋真菌Alternaria sp.MNP801的代谢产物研究中，从发酵液和菌体浸膏中分离到6个化合物，分别为过氧麦角甾醇(1)，6，7，8-三甲氧基香豆素(2)，6，7-二甲氧基香豆素(3)，邻苯二甲酸二异丁酯(4)，邻苯二甲酸二丁酯(5)，邻苯二甲酸二-(2-乙基)-己基酯(6)。化合物2-6均为首次从海洋真菌Alternaria sp.中分离得到的化合物。
　　验证实验表明化合物1对肿瘤细胞H460，3T3，PC12，U937具有强的抑制活性，优于对照标准品依托泊苷，其IC50值分别为0.122，0.096，0.020和0.034μmol·mL-1。化合物1、2、5和6对乙酰胆碱酯酶抑制活性显示，化合物1、2和5不具有有效地活性，化合物6对乙酰胆碱酯酶显示了有意义的抑制活性，其IC50值为0.079μmol·mL-1。化合物1、2和5相对Vc而言具有较弱的抗氧化活性，化合物1的IC50值为0.259μmol·mL-1。首次利用流式细胞仪对化合物1和2抑制U937肿瘤细胞作用机理进行了初步研究，结果显示化合物1和2对抑制U937细胞增值并诱导其凋亡，并以早期凋亡为主。

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摘要

论文中术语、缩略语一览表

第一章 绪论

1．1 海洋真菌研究的背景和意义

1．2 海洋真菌活性代谢产物研究进展

1．2．1 抗肿瘤活性物质

1．2．2 抗氧化活性物质

1．2．3 抗菌活性物质

1．2．4 酶抑制剂

1．3 本课题立题背景、意义

1．4 本课题研究内容

第二章 海洋真菌Alternaria sp．MNP801的大规模培养

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 实验试剂仪器

2．2．2 培养基制备

2．2．2 海洋真菌来源

2．2．4 实验细胞

2．3 实验方法

2．3．1 海洋真菌Alternaria sp．MNP801的复苏

2．3．2 海洋真菌Alternaria sp．MNP801的大规模培养及其浸膏制备

2．3．3 海洋真菌Alternaria sp．MNP801浸膏HPLC-UV-ELSD检测

2．3．4 总浸膏生物活性初步测试

2．4 结果与讨论

2．4．1 海洋真菌Alternaria sp．MNP801显微镜下形态

2．4．2 海洋真菌Alternaria sp．MNP801浸膏制备

2．4．3 海洋真菌Alternaria sp．MNP801浸膏HPLC-UV-ELSD谱图

2．4．4 浸膏对DPPH自由基的清除活性

2．4．5 浸膏对肿瘤细胞生长的抑制活性

2．5 小结

第三章 海洋真菌Alternaria sp．MNP801浸膏HPLC-UV-ELSD筛选谱的建立

3．1 引言

3．2 实验材料

3．3 实验方法

3．3．1 海洋真菌Alternaria sp．MNP801浸膏的初步分离

3．3．2 各组分MTT抗肿瘤活性追踪

3．3．3 组分E最佳HPLC-UV-ELSD条件的建立

3．3．4 HPLC-DPPH自由基清除活性联用

3．3．5 HPLC-MTT抗肿瘤活性联用

3．4 结果与讨论

3．4．1 各组分抗肿瘤活性

3．4．2 组分E的DPPH自由基清除活性导向HPLC-UV-ELSD-DPPH谱的建立

3．4．3 组分E的MTT抗肿瘤活性导向HPLC-UV-ELSD-MTT谱的建立

3．5 小结

第四章 海洋真菌Alternaria sp．MNP801活性次级代谢产物的导向分离和生物活性研究

4．1 引言

4．2 实验材料

4．3 实验方法

4．3．1 海洋真菌HPLC-MTT-DPPH活性导向谱的建立

4．3．2 化合物生物活性测试

4．4 结果与讨论

4．4．1 化合物结构鉴定

4．4．2 化合物生物活性测试

4．4．3 流式细胞仪检测细胞凋亡

4．5 小结

第五章 结论与展望

参考文献

附录

致谢

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