仙鹤草内生真菌活性菌株的分离筛选及其与宿主相互作用的研究

摘要

1.利用传统的分离方法从内蒙古产野生仙鹤草植株中分离获得17株内生真菌，从江西产仙鹤草中分离得到20株内生真菌，采用形态学鉴定，其主要归属于曲霉属、木霉属、毛霉属、镰孢霉属、酵母属。内蒙古及江西产仙鹤草内生菌株均以曲霉属为主，将其与本课题组前期从浙江产仙鹤草中分得的30株内生真菌进行比较，发现浙江产仙鹤草内生真菌以镰孢霉属主。浙江产仙鹤草生物多样性最显著。
　　2.本文对内蒙古产及江西产仙鹤草内生真菌菌株进行了活性筛选，结果显示，其中6株内生真菌菌株发酵产物具有较强的抗氧化活性，25株内生真菌菌株发酵产物能抑制胃癌细胞SGC的增殖，10株内生真菌菌株发酵产物对结肠癌细胞LOVO的增殖有一定的抑制作用。将内生菌株接种至含仙鹤草多酚粗提物的培养基中，测定其对仙鹤草粗提物中多酚类物质的转化作用。结果表明，21株内生真菌菌株能提高培养基中多酚类物质的含量，其中菌株R3-1提高幅度最大。采用分子生物学技术，鉴定R3-1菌株为黄曲霉（Aspergillusflavus）。
　　3.选取14株能提高多酚类物质含量的内生真菌菌株，采用人工接种的方法与仙鹤草组培苗进行共培养实验，筛选出1株能与组培苗共生且对组培苗的生长有促进作用的内生菌株(R2-2)。对该菌株进行分子生物学鉴定，确定为棘孢木霉Trichoderma spp.。将菌株R2-2接种至组培苗，在不同生长阶段测定组培苗次级代谢产物的含量。培养7周后，该菌株能使宿主多酚含量提高13.4％，黄酮类的含量提高1.9倍，其中芦丁含量提高67.7％，木犀草素含量提高71.3％。而其对宿主多糖类物质积累具有一定的抑制作用，对皂苷类物质积累影响不显著。
　　4.选取4株能降低多酚类物质的内生菌株R2-2，R3，R3-2，S8，分别对宿主黄酮类成分芦丁、木犀草素、槲皮素进行体外生物转化，对转化后的产物采用HPLC测定，培养四周后，4株菌株对三种黄酮类物质均有一定的转化作用。其中菌株S8对芦丁与槲皮素的转化率最高，分别为4.95％、16.4％。菌株R3对木犀草素的转化率最高为27.4％，菌株R2-2的生物转化作用不明显。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 植物内生真菌的定义与活性研究现状

1．1．1 植物内生真菌抗氧化活性的研究进展

1．1．2 植物内生真菌抗肿瘤活性的研究进展

1．2 药用植物内生真菌与宿主相互作用研究进展

1．2．1 促进有效成分的生成与积累

1．2．2 促进生长发育

1．2．3 增强抗逆性

1．3 微生物对黄酮类成分的生物转化研究进展

1．4 仙鹤草及其内生真菌的研究进展

1．4．1 仙鹤草

1．4．2 仙鹤草内生真菌的研究进展

1．5 本课题选题及研究意义

第二章 不同产地仙鹤草内生真菌的分离及活性菌株筛选

2．1 实验部分

2．1．1 实验仪器及材料

2．1．2 仙鹤草内生真菌的分离与纯化

2．1．3 内生真菌的发酵培养与样品制备

2．1．4 细胞培养

2．1．5 MTT法测定抗肿瘤活性

2．1．6 仙鹤草总酚粗提液制备

2．1．7 内生真菌对仙鹤草多酚积累的影响

2．1．8 活性菌株分子生物学鉴定

2．2 结果与分析

2．2．1 不同产地仙鹤草内生真菌的种类与分布

2．2．2 内生真菌菌株发酵产物的抗氧化活性研究

2．2．3 仙鹤草内生真菌发酵产物的抗肿瘤活性

2．2．4 影响仙鹤草多酚类积累的活性菌株筛选

2．2．5 活性菌株分子生物学鉴定

2．3 讨论

第三章 仙鹤草内生真菌对宿主活性成分累积的影响

3．1 实验部分

3．1．1 实验材料与仪器

3．1．2 仙鹤草组配苗的培养

3．1．3 组培苗共生菌株的筛选

3．1．4 人工接种组培苗的内生真菌再分离

3．1．5 内生菌株对宿主碳素吸收的影响

3．1．6 供试品溶液的制备

3．1．7 活性成分含量比色测定

3．1．8 液相色谱测定

3．2 结果与分析

3．2．1 仙鹤草组培苗共生内生真菌的筛选

3．2．2 内生菌株对宿主碳素吸收的影响

3．2．3 仙鹤草内生菌株对宿主总酚物质积累的影响

3．2．4 仙鹤草内生菌株对宿主总黄酮物质积累的影响

3．2．5 仙鹤草内生菌株对宿主总多糖物质积累的影响

3．2．6 仙鹤草内生菌株对宿主总皂苷物质积累的影响

3．2．7 内生真菌侵染对宿主芦丁、木犀草素及没食子酸含量的影响

3．3 讨论

第四章 仙鹤草内生真菌对宿主黄酮类物质的转化

4．1 实验部分

4．1．1 实验试剂及仪器

4．1．2 培养基

4．1．3 内生菌株的培养

4．1．4 空白对照制备

4．1．5 转化试验

4．1．6 HPLC法测定底物含量

4．2 结果与分析

4．2．1 仙鹤草内生菌株对芦丁的生物转化

4．2．2 仙鹤草内生真菌菌株对槲皮素的生物转化

4．2．3 仙鹤草内生真菌菌株对木犀草素的生物转化

4．3 讨论

第五章 结论与展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间参加的科研项目和成果