维罗纳假单胞菌ZW代谢α--蒎烯过程分析及关键酶分离鉴定

摘要

α-蒎烯是一种典型的挥发性有机化合物，对人体和环境具有危害性。运用微生物技术降解α-蒎烯是一种有效的方法。通过对污染物诱导胁迫下的降解菌蛋白质组学的分析，能够鉴定出参与环境污染物代谢的酶，为深入了解生物代谢污染物过程提供了依据。 本研究以实验室早期分离筛选到的1株α-蒎烯高效降解菌Pseudomonas veronii ZW作为供试菌株，运用传统生物学并结合现代分子生物学技术对菌株ZW在α-蒎烯诱导下的代谢机理进行了研究。 菌株ZW降解α-蒎烯的过程符合Haldane动力学模型，最大比生长速率为0.10253h-1、最大比降解速率为0.33586 h-1。通过GC-MS检测到菌株ZW降解α-蒎烯产生的中间产物，并结合相关文献，推测出菌株ZW降解α-蒎烯的三条可能代谢途径:①α-蒎烯转化为桃金娘烯醇，桃金娘烯醇再进一步转化为桃金娘烯酸;②α-蒎烯转化为柠檬烯;③α-蒎烯转化为伞花烃，伞花烃转化为4-异丙基苯甲醇和3-羟基-4-异丙基甲苯。4-异丙基苯甲醇最终形成2-甲基-1，4丁二酸和乙二酸和乙酸等小分子有机酸类物质，进入TAC循环。 利用紫外诱变获得一株丧失α-蒎烯降解能力的菌株ZW-U，其形态和抗生素敏感性与正常菌株ZW基本保持一致。诱变菌株ZW-U对α-蒎烯、伞花烃、4-异丙基苯甲醇和2-甲基-1，4丁二醇的降解能力明显下降甚至丧失了降解能力，这可能与紫外诱变使得菌株ZW-U缺失了α-蒎烯、伞花烃、4-异丙基苯甲醇和2-甲基-1，4丁二醇的降解酶或者抑制了这些酶的合成。 利用双向电泳及生物质谱技术分离并鉴定了16个特异性差异蛋白质。根据蛋白质的功能，将这些差异性蛋白分为氨基酸合成、能量转化、蛋白折叠、解毒或保护蛋白、调节蛋白、与α-蒎烯代谢相关蛋白等6大类。其中与α-蒎烯代谢有关的酶是PKHD型羟化酶和芳基醇脱氢酶。PKHD型羟化酶作用于伞花烃转化为3-羟基-4-异丙基甲苯;芳基醇脱氢酶作用于4-异丙基苯甲醇转化为4-异丙基苯甲醛。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 α-蒎烯理化性质及危害

1．2 α-蒎烯的微生物降解种类及代谢产物

1．3 微生物的诱变选育

1．3．1 诱变育种

1．3．2 诱变剂及诱变机制

1．3．3 诱变育种在微生物中的应用

1．4 资源化

1．5 微生物蛋白质组学

1．5．1 蛋白质组学主要技术

1．5．2 蛋白质组学在微生物研究中的应用

1．6 本研究的主要目的、意义及主要内容

1．6．1 本研究的主要目的及意义

1．6．2 本研究的主要内容

1．6．3 本研究的创新点

1．6．4 课题来源

第二章 实验材料及分析方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验药品

2．1．2 实验仪器

2．1．3 菌种来源与培养基

2．2 分析方法

2．2．1 分析检测方法

2．2．2 动力学研究

2．2．3 中间产物分析

2．2．4 中间代谢产物对菌株降解α-蒎烯的影响

2．2．5 菌株诱变

2．2．6 抗生素敏感试验

2．2．7 正常菌株和突变株降解底物的广谱性

2．2．8 正常菌株和突变株对中间产物降解分析

2．2．9 蛋白分析与检测

第三章 菌株ZW降解α-蒎烯代谢途径分析及降解动力学研究

3．1 菌株ZW降解α-蒎烯的动力学特征

3．2 菌株ZW降解α-蒎烯的代谢中间产物测定

3．3 菌株ZW代谢α-蒎烯的可能代谢途径

3．4 主要代谢产物对菌株降解α-蒎烯的影响

3．5 本章小结

第四章 α-蒎烯降解缺失功能菌株的获得及特性对比研究

4．1 菌株ZW与ZW-U的形态学比较

4．2 菌株ZW与ZW-U的抗生素敏感性试验

4．3 菌株ZW与ZW-U对α-蒎烯降解特性分析

4．4 菌株ZW与ZW-U降解底物的广谱性比较

4．5 菌株ZW与ZW-U对α-蒎烯的主要代谢产物降解能力比较

4．6 菌株ZW与ZW-U全细胞蛋白质电泳谱图比较

4．7 本章小结

第五章 菌株ZW降解α-蒎烯的蛋白表达图谱研究

5．1 α-蒎烯诱导的全细胞SDS-PAGE电泳

5．2 双向电泳研究α-蒎烯诱导表达蛋白

5．3 特异性蛋白提取与鉴定

5．4 α-蒎烯诱导表达蛋白的分类及其作用

5．5 菌株ZW降解α-蒎烯的代谢途径

5．6 本章小结

第六章 主要结论和研究展望

6．1 主要结论

6．2 建议

参考文献

致谢

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