紫贻贝多糖提取分离、结构鉴定及其生物活性的初步研究

摘要

贻贝是重要的世界性养殖品种,以紫贻贝产量占有最大,并以新鲜贻贝为主要销售形式,经济效益低。贻贝不但作为传统的滋补食品,且具有较高的营养价值和多种药理功效。文献报道,贻贝及其提取物具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、降血脂等功能活性。其中,多糖是紫贻贝中的主要活性成分之一,目前对其研究主要集中在紫贻贝粗多糖上,而对紫贻贝多糖组分的提取、分离纯化及结构功能研究报道较少。因此,开发利用紫贻贝多糖具有理论价值和实际意义。本课题以嵊泗枸杞所产紫贻贝为试验材料,研究了紫贻贝多糖的提取、脱蛋白、分离纯化、结构鉴定及其免疫抗肿瘤活性。主要研究结果如下:
　　 采用响应面方法优化紫贻贝多糖的热水提取工艺。实验以冷冻干燥后的紫贻贝粉末为原料,研究了浸取温度、浸取时间及液固比对紫贻贝多糖得率的影响,确定了提取的最佳工艺参数为:浸提温度93℃,浸提时间4.2h,液固比44.3:1,在此条件下多糖得率可达19.73％。
　　 对热水提取醇沉后所得紫贻贝粗多糖MES进行脱蛋白工艺的研究。本实验采用三种不同方法-Sevag法、酶法和酶法与Sevag联用法并比较了对MES的脱蛋白的效果。结果表明酶法与Sevag联用法为最合适的方法,其工艺条件为:酶法:酶种为碱性蛋白酶,最优酶解参数:酶量[E]/[S]1.79％,pH9.19,酶解温度61.79℃；Sevag法:氯仿:正丁醇=4:1(V/V),料液比=3:1(V/V),通过三次脱蛋白处理。
　　 对经酶法与Seveg联用法脱蛋白后的紫贻贝多糖MES-Ⅰ进行分离纯化研究。本实验先将MES-Ⅰ溶液过0.45μm微孔滤膜抽滤,其后采用10000的超滤膜进行超滤处理。再通过Marco-Prep DEAE离子交换层析和Sephrose4B凝胶柱层析进一步分离纯化得到三个组分(MES-Ⅰ-11、MES-Ⅰ-12和。MES-Ⅰ-2)。采用Sephrose6B凝胶过滤层析法、高效液相色谱(HPLC)和醋酸薄膜电泳三种方法对三个组分进行纯度分析,确定MES-Ⅰ-11、MES-Ⅰ-12和MES-Ⅰ-2为均一多糖组分。
　　 研究了MES-Ⅰ-11、MES-Ⅰ-12和MES-Ⅰ-2三个均一组分的理化性质和初级结构。通过苯酚-硫酸法测定,MES-Ⅰ-11、MES-Ⅰ-12和MES-Ⅰ-2的总糖含量分别为95.2％、91.2％和94.8％。颜色反应和紫外光谱(UV)法检测推断三个均一组分都不含有蛋白质和核酸。HPLC法测定了MES-Ⅰ-11、MES-Ⅰ-12和MES-Ⅰ-2的分子量分别为572.8KD、18.20KD和69.50KD。采用傅里叶红外光谱(FT-IR)法初步判断三个组分为糖类化合物,且其多糖结构均含有α-D-葡萄吡喃糖苷键。气质联用(GC-MS)法分析表明MES-Ⅰ-11、MES-Ⅰ-12和MES-Ⅰ-2分别由不同摩尔比的3种单糖-甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成。其中,MES-Ⅰ-11的组成成分甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩尔比为2.74:1:18.06；MES-Ⅰ-12的摩尔比为2.2:1:19.44；MES-Ⅰ-2的摩尔比为2.87:1:3.63。核磁共振法(NMR)分析结果是MES-Ⅰ-11、MlES-Ⅰ-12和MES-Ⅰ-2均有α-D-葡萄糖吡喃糖苷,且在C6上有发生羟基被取代,主要以α-D-Glc(1→4)-为主要的连接方式。
　　 采用噻唑盐(MTT)比色法研究MES-Ⅰ-1、MES-Ⅰ-2、MES-Ⅰ-11和MES-Ⅰ-12的免疫活性。结果表明,在Con A诱导小鼠T淋巴细胞的体外增殖中,各组分均不同程度抑制细胞的增殖反应。在高浓度时有明显抑制作用,显著性分别为P<0.01、P<0.001、P<0.05、P<0.01。在LPS诱导小鼠B淋巴细胞的体外增殖反应中,MES-Ⅰ-1和MES-Ⅰ-12没有显著影响,MES-Ⅰ-2在高浓度下呈促进作用(P<0.05),MES-Ⅰ-11在中浓度下也呈促进作用,在低浓度条件下则呈增殖抑制作用(P<0.05)。对K562肿瘤细胞的抗肿瘤活性研究实验表明,MES-Ⅰ-1、MES-Ⅰ-2、MES-Ⅰ-11和MES-Ⅰ-12在各浓度下均表现出不同程度的抗肿瘤活性,并呈一定的量效关系,其中MES-Ⅰ-2在低浓度和高浓度时的抑瘤率分别为24.48±1.72％和62.82±8.57％,表现出较强的抗肿瘤作用。