异硫代氰酸酯抗癌活性及MTBITC诱导A549细凋亡机理的研究

摘要

近年来，肺癌的发病率和死亡率在世界范围内呈不断上升趋势，其中80％-85％表现为非小细胞肺癌。流行病学研究表明，十字花科蔬菜的摄入可降低癌症的患病率，其最有效成分为硫代葡萄糖苷(简称硫苷)的降解产物-异硫代氰酸酯(ITCs)。目前，对十字花科蔬菜中ITCs的研究主要集中在组分分析及含量的测定，而对其单体的分离研究较少；ITCs的结构与活性之间的关系尚不明确；其诱导肿瘤凋亡机制尚未见详尽报道。莱菔素(MTBITC)诱导人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的信号转导途径及作用机理的研究尚未见报道。
　　 本论文以分离得到的5个ITCs为研究对象，对其体外抗肿瘤活性进行了药效学评价，并从量子化学角度分析了其结构与活性的关系。并以人非小细胞肺癌A549细胞为靶细胞，研究了MTBITC诱导A549细胞凋亡的机理。主要研究结论如下：
　　 1、为优化硫苷的酶解条件，以一点红萝卜种子为研究对象，MTBITC得率为指标，采用响应面法优化确定最佳酶解条件为：酶解温度25℃，酶解时间8h,Vc添加量0.06mg/g，酶解pH值为3.71。MTBITC的实际得率为3.53mg/g。
　　 2、采用丙酮提取，利用多种现代色谱技术(硅胶柱层析，Sephadex LH-20凝胶色谱，高效液相制备等)从一点红萝卜、澄海粗条芥蓝、牛心甘蓝、西兰花种子中分离得到了5个ITCs，分别鉴定为莱菔素(MTBITC)(Ⅰ)、3-(甲硫基)丙基异硫代氰酸酯(Iberverin)(Ⅱ)、萝卜硫素(Sulforaphane)(Ⅲ)、3-(甲磺酰基)丙基异硫代氰酸酯(Iberin)(Ⅳ)和3-丁烯基异硫代氰酸酯(3-BITC)(Ⅴ)。
　　 3、对5个ITCs体外抗肿瘤活性的药效学评价表明，MTBITC、Sulforaphane和Iberin对人肺癌A549和LAC、人肝癌HepG2、人宫颈癌HELA细胞均有明显的抑制作用。A549细胞对MTBITC的敏感性最强；MTBITC, Sulforaphane和Iberin对HepG2、LAC和HELA细胞的抑制作用相似，但明显强于Iberverin和3-BITC。
　　 4、基于DMol3模块，从量子化学角度对5个ITCs进行几何构型优化，在此结构基础上进行Mulliken电荷分布及前线轨道能量计算，分析了ITCs的活性位点，及其抗癌活性与电子结构的关系。结果表明，ITCs的特征基团N=C=S中间C原子作为亲电位点，侧链上的磺酰基和硫基为辅助位点，使其具有一定的抗癌活性。ITCs的抗癌活性差异与ITCs分子的负电荷分布、前线分子轨道的离域性及最低未占据轨道能量和最高占据轨道能量的差值(△EL-H)有关。
　　 5、MTBITC以剂量-时间依赖性抑制A549细胞增殖，其抑制肿瘤细胞增殖主要通过诱导细胞凋亡，而非坏死。形态学研究，发现MTBITC使A549细胞出现典型的凋亡形态；PI单染和AnnexinV/PI双染流式细胞术分析，表明A549细胞经MTBITC处理后出现明显的凋亡峰，细胞周期阻滞于S期和G2/M期，细胞以早期凋亡为主，呈剂量依赖性。分子对接研究表明，MTBITC与微管蛋白疏水区域内部的Cys347残基以共价键结合，与Lys352残基以氢键结合，说明MTBITC通过影响微管蛋白的价键，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡。
　　 6、采用RT-PCR法、流式细胞术、Caspase分光光度检测法等，分析凋亡过程中相关基因mRNA表达情况，检测线粒体膜电位(ΔΨm)、活性氧(ROS)、Ca2+浓度及Caspase-3、-8、-9的变化，探讨MTBITC诱导A549细胞凋亡的机理。结果显示，MTBITC使△Ψm降低，细胞内游离的ROS和Ca2+浓度含量升高，Bcl-2、Bcl-xL的mRNA表达下调，Bax和Bid mRNA表达上调，Caspase-9被激活，且具有时间依赖性，说明线粒体途径和Bcl-2基因家族参与了MTBITC诱导A549细胞凋亡的调控。同时，MTBITC使细胞Fas、FasL、FADD mRNA表达增强，Caspase-8，-3活性升高，且具有时间依赖性，表明MTBITC通过Fas途径引起A549细胞凋亡。
　　 结果证明，MTBITC通过改变微管蛋白的价键，从而阻滞细胞的周期，并通过线粒体和Fas受体信号通路，进而激活Caspase级联反应诱导A549细胞凋亡。该凋亡效应也与钙离子相关的活性氧信号通路有关。本论文的研究结果为深度开发十字花科植物资源提供了科学依据，为ITCs治疗肺癌类疾病提供了基础研究数据。

目录

文摘

英文文摘

第1章 引言

1.1 异硫代氰酸酯抗癌活性的研究进展

1.1.1 异硫代氰酸酯调节Ⅰ相酶和Ⅱ相酶解毒途径

1.1.2 异硫代氰酸酯保护DNA化学损伤

1.1.3 异硫代氰酸酯诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期

1.2 异硫代氰酸酯在十字花科蔬菜中的形成和分布

1.2.1 硫代葡萄糖苷

1.2.2 黑芥子酶及其复合体

1.2.3 硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系统

1.3 异硫代氰酸酯性质及分离方法的研究进展

1.3.1 异硫代氰酸酯的化学性质

1.3.2 异硫代氰酸酯的检测方法

1.3.3 异硫代氰酸酯提取分离的研究进展

1.4 抗肿瘤活性物构效关系的研究进展

1.4.1 结构化学

1.4.2 定量构效关系

1.4.3 抗肿瘤天然产物结构与功能关系的研究进展

1.5 诱导肿瘤细胞凋亡机理的研究进展

1.5.1 细胞凋亡的生物学特征

1.5.2 细胞凋亡的一些调控因素

1.5.3 启动细胞凋亡的信号途径

1.5.4 微管蛋白的功能与肿瘤的关系

1.6 立题背景、主要研究内容及意义

1.6.1 立题背景

1.6.2 主要研究内容及意义

第2章 硫苷酶解条件优化及异硫代氰酸酯的分离、鉴定

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 主要仪器及设备

2.2.3 实验方法

2.3 结果与分析

2.3.1 酶解条件的优化

2.3.2 化合物Ⅰ结构鉴定

2.3.3 化合物Ⅱ结构鉴定

2.3.4 化合物Ⅲ结构鉴定

2.3.5 化合物Ⅳ结构鉴定

2.3.6 化合物V结构鉴定

2.4 小结

第3章 异硫代氰酸酯结构与抗癌活性关系的研究

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 异硫代氰酸酯对A549细胞生长的影响

3.3.2 异硫代氰酸酯对LAC细胞生长的影响

3.3.3 异硫代氰酸酯对HepG2细胞生长的影响

3.3.4 异硫代氰酸酯对HELA细胞生长的影响

3.3.5 异硫代氰酸酯对不同肿瘤细胞作用72h的半数抑制浓度(IC50)

3.3.6 Mull iken布局分析

3.3.7 前线分子轨道(FMO)分析

3.4 小结

第4章 MTBITC诱导A549细胞凋亡机理的研究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 实验方法

4.3 结果

4.3.1 MTBITC可抑制A549细胞增殖

4.3.2 MTBITC可诱导A549细胞凋亡

4.3.3 MTBITC通过与微管蛋白结合抑制细胞周期

4.3.4 MTBITC诱导A549细胞发生Capase相关的凋亡

4.3.5 线粒体信号通路参与MTBITC诱导A549细胞凋亡

4.3.6 死亡受体通路参与MTBITC诱导A549细胞凋亡

4.4 讨论

4.5 小结

第5章 结论、创新点与展望

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

论文缩略词

博士期间发表的论文和参与的研究课题

致谢