亲和性离子液体的合成及应用于组氨酸标签蛋白纯化的研究

摘要

离子液体(Ionic Liquids，ILs)是近年来研究广泛的一种绿色溶剂。离子液体具有很多优良的特性，比如宽的液态范围、热力学稳定性、高离子电导率等，而且离子液体与很多有机物溶解性良好、可燃性低、蒸汽压可忽略。以上特性使离子液体被应用于众多的全新的领域，比如耐高温润滑剂、萃取溶剂、合成与催化的反应溶剂及太阳能或燃料电池的新式电解液。离子液体通常被用作传统有机溶剂的环境友好型替代品应用在化学反应中作为分子溶剂使用。近期，离子液体的功能化研究兴起，通过离子液体支载功能化基团赋予离子液体额外的功能特性。本文以离子液体作为萃取溶剂，利用离子液体可设计的特性将氮杂大环功能性配体与疏水性离子液体链接构建亲和性离子液体（Affinity Ionic Liquid，AIL），通过氮杂大环螯合金属离子构成复合物，利用螯合的金属离子对组氨酸标签特异的亲和性对组氨酸标签蛋白进行特异性亲和纯化。主要研究内容如下:
　　(1)以咪唑、1-溴辛烷、1，6-二溴己烷等为基本原料合成烷基咪唑阳离子;以乙二醇、二乙烯三胺、对甲苯磺酰氯为基本原料合成功能性配体;链接烷基咪唑阳离子与功能性配体，并通过阴离子交换得到疏水性AIL。主要中间产物及最终产物均通过NMR、MS等方法进行结构鉴定。
　　(2)对于AIL与离子液体[bdmim][NTf2]构成的离子液体二元萃取体系进行金属离子螯合特性测试。配制含梯度AIL质量的二元萃取体系，分别螯合Cu2+、Ni2+、Zn2+三种金属离子，通过原子吸收分光光度计火焰法测金属离子吸收量。发现当AIL含量过高时“三明治结构”的形成会影响金属离子结合量。通过FITC-(His)6-OH测试了AIL对于聚六组氨酸多肽的亲和性，结果表明只有当AIL螯合金属离子后才会对FITC-(His)6-OH产生亲和性。
　　(3)在不同离子强度条件下研究了M-AIL(M=Cu、Ni、Zn)对组氨酸标签增强型绿色荧光蛋白(His-tag EGFP)萃取量的变化。结果表明，随着离子强度的升高Cu-AIL结合His-tag EGFP的量减少，Ni-AIL、Zn-AIL的结合量逐渐上升。说明了离子强度对于亲和介质与蛋白质之间的静电效应及疏水作用的影响。同时，研究了不同AIL含量的萃取体系对于His-tag EGFP萃取量的影响，表明金属离子与AIL形成的“三明治结构”是影响蛋白质的萃取量的重要因素。
　　(4)将M-AIL应用于大肠杆菌表达总蛋白的中His-tag EGFP的纯化。选择适宜的AIL含量，在高离子强度条件下进行His-tag EGFP的纯化。结果表明:Cu-AIL亲和性最强，对于His-tag EGFP的选择性最差;Ni-AIL受限于其低的金属离子结合量，获得的目的蛋白最少;Zn-AIL能有效地亲和His-tag EGFP，纯化效率相对最佳。并结合以上不同亲和介质的特性，开发出了利用Zn-AIL与Cu-AIL的二次纯化体系，获得了纯度约为90％的His-tag EGFP。
　　(5)重复利用能力是离子液体利用的一项重要指标，本文研究了M-AIL连续使用过程中对His-tag EGFP亲和能力的变化。结果表明M-AIL虽然在经过咪唑洗脱后其亲和性有显著的下降，但是离子液体重复使用性能良好。最后利用EDTA解吸金属离子，重新装载金属离子后亲和性能大幅上升，验证了AIL重新装载金属离子的能力及亲和性能恢复的方法。

目录

摘要

第1章 引言

1．1 离子液体

1．1．1 离子液体的特性

1．1．2 离子液体的应用

1．2 功能化离子液体(Functionalized ionic liquids，FILs)

1．2．1 功能化离子液体的合成

1．2．2 功能化离子液体的应用前景

1．3 固定化金属离子亲和色谱(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)

1．3．1 IMAC基本原理

1．3．2 1，4，7-triazacyclononane(tacn)在IMAC中的应用

1．4 功能化离子液体应用于蛋白纯化

1．4．1 基于离子液体的辅助萃取体系

1．4．2 亲和性离子液体(Affinity ionic liquid，AIL)

1．5 应用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和性离子液体液液萃取体系的设计及研究

1．5．1 液液萃取技术

1．5．2 亲和性离子液体萃取体系的设计及研究

1．5．3 本研究的主要意义

第2章 亲和性离子液体的合成

2．1 试剂与仪器

2．2 亲和性离子液体的合成路线及方法

2．2．1 1，4-dimethy1-1，4，7-triazacyclononane的合成

2．2．2 亲和性离子液体的合成

2．3 实验结果

2．3．1 1，4-dimethy1-1，4，7-triazacyclononane及主要中间产物数据

2．3．2 亲和性离子液体及中间产物数据

2．4 本章小结

第3章 亲和性离子液体螯合金属离子及其亲和性能的研究

3．1 试剂与仪器

3．2 亲和性离子液体与金属离子螯合特性分析

3．2．1 亲和性离子液体与金属离子的结合与解吸

3．2．2 亲和性离子液体结合金属离子量的检测

3．3 亲和性离子液体与聚组氨酸多肽亲和性能的研究

3．3．1 亲和性离子液体与FITC-(His)6-OH的准备

3．3．2 亲和性离子液体与FITC-(His)6-OH的亲和测试

3．4 结果与讨论

3．4．1 亲和性离子液体与金属离子的螯合特性

3．4．2 亲和性离子液体螯合金属离子后对聚六组氨酸多肽的亲和

3．5 本章小结

第4章 离子强度及亲和性离子液体浓度对于亲和介质与组氨酸标签增强型绿色荧光蛋白结合的影响

4．1 试剂与仪器

4．2 试验方法

4．2．1 His-tag EGFP与M-AJL在不同离子强度下的亲和与洗脱

4．2．2 AIL浓度对M-AIL与His-tag EGFP结合的影响

4．2．3 BCA法测定洗脱蛋白浓度

4．3 结果与讨论

4．3．1 离子强度对M-AIL亲和His-tag EGFP的影响

4．3．2 AIL浓度对M-AIL与His-tag EGFP结合的影响

4．4 本章小结

第5章 亲和性离子液体液液萃取纯化大肠杆菌表达的组氨酸标签增强型绿色荧光蛋白

5．1 试剂与仪器

5．2 试验方法

5．2．1 IMAC法纯化大肠杆菌表达粗蛋白中的His-tag EGFP

5．2．2 通过M-AIL纯化大肠杆菌表达粗蛋白中的His-tag EGFP

5．2．3 Zn-AIL与Cu-AIL对于His-tag EGFP的二次纯化

5．2．4 SDS-PAGE分析

5．3 结果与讨论

5．4 本章小结

第6章 M-AIL重复利用能力以及重复利用方法的研究

6．1 试剂与仪器

6．2 M-AIL的重复利用测试

6．3 结果与讨论

6．4 本章小结

第7章 总结、创新点与展望

7．1 总结

7．2 创新点

7．3 展望

参考文献

附录1：主要合成产物核磁、质谱图

附录2：研究生期间发表论文情况

致谢

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