土壤环境中土霉素粪肥施用引起的抗性基因污染特征及机理浅析

摘要

为了更好地掌握农用土壤环境中低浓度抗生素长期胁迫引起的ARGs污染特征、给生态安全评估提供重要的理论依据与数据支撑，本论文以四环素类抗生素抗性基因作为主要研究对象，采用实验室模拟的方式研究了土壤环境中三种四环素类抗生素的暴露引起的抗性基因丰度变化;以土霉素为例，探究了抗生素浓度与粪肥施用方式对抗性基因产生的影响。此外，通过群体感应抑制剂的投加对土壤环境中抗性基因污染形成的群体感应机理进行了剖析。本研究所获得的主要结果如下:
　　(1)三种不同四环素类抗生素，随着粪肥施用进入土壤后，呈现持续消减的现象，140 d内消减率均达90％，且三种抗生素在土壤环境中的消减规律没有显著性差异(p＞0.05）。聚类分析表明四环素类抗生素特别是金霉素的暴露显著影响了土壤环境中微生物的群落结构，多样性分析表明土霉素和四环素处理组之间种群多样性和均匀性不存在显著性差异(p＞0.05）。虽然抗性基因tet(A)，tet(L)，tet(M)，tet(Q)产生丰度存在差异但均呈现先增后减的趋势，且丰度均在10-5～10-3范围;三种抗生素暴露下，tet(L)，tet(M)的丰度没有显著的差异，而tet(A)，tet(Q)丰度存在一定差异，但均高于对照组(p＜0.05）。
　　(2)不同浓度的土霉素在土壤中的消减率基本维持在50％左右，反复施用不同浓度的土霉素粪肥都造成了土壤环境中土霉素的累积。三种低浓度土霉素粪肥反复添加，对土壤中微生物群落结构影响较小，且对微生物种群多样性亦未造成显著影响(p＞0.05）。基因tet(M)和tet(Q)丰度与土壤中土霉素的残留浓度具有显著的相关性(R2=0.965，p＜0.01和R2=0.932，p＜0.01)。当土霉素浓度小于40μg/kg，tet(A)和tet(L)丰度随土霉素残留浓度累积缓慢增加;当土霉素浓度大于40μg/kg，tet(A)和tet(L)丰度显著增加。
　　(3)粪肥投加频次的差异显著影响土壤中土霉素的积累。处理140 d后140 d/次、28 d/次和14 d/次投加频次组中土霉素残留浓度分别为65.05μg/kg、137.78μg/kg和315.50μg/kg。投加相同浓度的土霉素情况下，投加频次越高，其在土壤中的残留浓度越高。三种土霉素粪肥投加频次处理对土壤中微生物群落结构没有显著影响。对于tet(A)和tet(L)而言，投加频次越多，其丰度累积越高;对于tet(M)和tet(Q)而言，14d/次投加频次丰度最高，而28d/次的投加频次下基因丰度最低。三种粪肥投加频次处理下，土霉素残留浓度和四种抗性基因丰度均没有显著的相关性。粪肥的施用方式是影响TRGs丰度变化的另一个重要因素，需要合理控制粪肥施用频率。
　　(4)土壤环境中4-NPO和3，4-二溴-2(5H)-呋喃酮这两种群体感应抑制剂的投加确实能干扰AHEs类信号分子的分泌，群体感应抑制剂4-NPO和卤代呋喃酮对于土壤中信号分子C4-HSL、C6-HSL和C8-HSL降解显著，但对3-oxo-C6-HSL降解作用不明显。抑制剂处理组投加抑制剂前后和对照组CK2相比抗生素消减率均没有显著性差异(p＞0.05），群体感应抑制剂对土壤中土霉素的消减不存在作用。两种抑制剂的添加均能引起土壤微生物移动元件intI1丰度的衰减，但连续的4-NPO处理后效果最为显著。这说明群体感应可以通过影响基因水平转移进而影响土壤中抗性基因丰度的变化。4-NPO的投加显著降低了外排泵基因(tet(A)和tet(L))的丰度，但对核糖保护蛋白基因(tet(M)和tet(Q))丰度的影响不大;卤代呋喃酮的连续投加使得tet(L)和tet(Q)基因出现不可逆的衰减，但对tet(A)和tet(M)基因的丰度影响不大。微生物群体感应可以促进抗性基因丰度的增加，但是不同群体感应抑制剂对抗性基因的控制效果不一。

目录

摘要

1 绪论

1．1 抗生素及四环素类抗生素概况

1．1．1 抗生素的主要种类及其用途

1．1．2 土壤环境四环素类抗生素的来源及污染现状

1．1．3 土壤环境中四环素类抗生素污染的生态影响

1．2 新型环境污染物——抗生素抗性基因

1．2．1 四环素类抗生素抗性基因类型

1．2．2 土壤环境中抗生素抗性基因的产生及危害

1．2．3 抗生素抗性基因的研究进展

1．3 抗生素抗性基因的主要研究方法与检测技术

1．4 论文研究内容

2 粪肥中的抗生素种类对抗性基因丰度的影响

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验方法

2．2．4 分析项目

2．3 结果

2．3．1 抗生素残留情况

2．3．2 抗生素胁迫对微生物群落结构的影响

2．3．3 四环素类抗生素胁迫下抗性基因的丰度变化

2．4 讨论

2．4．1 抗生素的残留

2．4．2 微生物群落结构

2．4．3 四环素类抗性基因丰度

2．5 小结

3 粪肥中土霉素浓度对抗性基因丰度的影响

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验仪器

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验方法

3．2．4 分析项目与数据处理

3．3 结果

3．3．1 土壤的理化性质

3．3．2 土壤中土霉素的残留情况

3．3．3 粪肥施用对微生物群落结构的影响

3．3．4 投加浓度对抗性基因丰度的影响

3．4 讨论

3．4．1 土霉素的残留

3．4．2 微生物群落结构

3．4．3 四环素类抗性基因丰度

3．5 小结

4 粪肥施用方式对抗性基因丰度的影响

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验试剂

4．2．3 实验方法

4．2．4 分析项目与数据处理

4．3 结果

4．3．1 土壤中土霉素的残留情况

4．3．2 粪肥施用频次对微生物群落结构的影响

4．3．3 粪肥施用频次对抗性基因丰度的影响

4．4 讨论

4．5 小结

5 抗生素抗性基因污染形成的群体感应效应机理浅析

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验仪器

5．2．2 实验试剂

5．2．3 实验方法

5．2．4 分析项目与数据处理

5．3 结果

5．3．1 群体感应抑制剂对微生物生长及信号分子分泌的影响

5．3．2 群体感应抑制剂对土壤中土霉素残留的影响

5．3．3 群体感应抑制剂对微生物抗性基因相关移动元件intI1的影响

5．3．4 群体感应抑制剂对土壤中抗性基因丰度变化的影响

5．4 讨论

5．4．1 AHLs信号分子的分泌

5．4．2 土霉素残留

5．4．3 移动元件intI1的丰度变化

5．4．4 抗性基因丰度变化

5．5 小结

6 结论

6．1 研究结论

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

攻读硕士学位期间研究成果

致谢

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