中等纯度重组人表皮生长因子（rhEGF）的分离纯化及在美容产品中的应用

摘要

基因重组人表皮生长因子(recombinant human Epidermal Growth Factor,rhEGF)在医学上有显著的创伤修复、愈合伤口等功效.近年来发现,rhEGF在美容产品领域也有广阔的应用前景,具有促进皮肤细胞更新、防止皮肤衰老等功能.采用分泌型表达的基因工程大肠杆菌培养获得rhEGF,根据美容等日化行业对rhEGF的质量与纯度要求,设计了一条成本低廉、简便快速、能满足日化产品活性添加纯度要求的rhEGF分离工艺,得到了中等纯度的rhEGF冻干粉产品,并试制出含rhEGF的美容化妆品,观察了使用效果.通过启发式方法设计了分离纯化rhEGF的工艺路线,包括基因工程大肠杆菌发酵液离心得到上清液、上清液盐析、透析脱盐、离子交换树脂层析、再脱盐、脱色和冻干等过程.通过正交和单因素试验考察了各因素的影响程度和最佳的水平.研究了中等纯度rhEGF冻干粉中rhEGF活性在不同温度、pH和稳定保护剂等条件下的变化,开发了在美容化妆品中添加rhEGF的关键工艺,并利用随机双盲法结合统计学分析研究了含rhEGF的美容化妆品使用疗效的显著性.研究结果表明中等纯度rhEGF冻干粉符合美容化妆品的添加要求,分离操作简便,产品成本低廉.试制的含甘露醇、HA与丝蛋白保护和增效的rhEGF美容化妆品达到了预期的去痘修复、去皱、抗衰老与美白等效果,为rhEGF大规模用于日化产品打下了基础.

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

1.1生长因子、表皮生长因子及人表皮生长因子

1.2 hEGF的生物学效应及其作用基本机理

1.2.1 hEGF的生物学效应

1.2.2 hEGF与hEGF受体((hEGF-R)

1.2.3 hEGF与hEGF-R结合的信号传递过程

1.2.4 hEGF与hEGF-R结合的复合物对蛋白激酶的活性

1.3 hEGF的来源——内源性hEGF与外源性hEGF

1.3.1内源性hEGF

1.3.2应用固相化学人工合成hEGF

1.3.3基因重组生产rhEGF

1.4 hEGF的定性、定量及活性检测

1.4.1定性检测

1.4.2定量检测

1.4.3生物活性检测

1.5 hEGF的分离纯化工艺

1.5.1天然内源性hEGF的分离纯化工艺

1.5.2 rhEGF的分离纯化工艺

1.6 hEGF的应用

1.6.1 hEGF应用的基础问题研究

1.6.2 hEGF的应用

1.6.3国内外hEGF产业化的现状

1.7展望

1.8本文研究目标与思路

1.8.1研究目标

1.8.2研究思路与方法

参考文献

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1 rhEGF的表达质粒及其宿主菌株

2.1.2培养基

2.2实验方法

2.2.1质粒的转化及转化筛选:按通用的方法

2.2.2种子培养和发酵生产rhEGF

2.3分析方法

2.3.1 rhEGF定性分析

2.3.2 rhEGF定量分析

2.3.3色素测定方法

2.3.4总蛋白含量粗略测定

参考文献

第三章大肠杆菌发酵液中rhEGF的初步分离

3.1材料与方法

3.1.1 rhEGF发酵离心液制备

3.1.2仪器与试剂

3.1.3分析方法

3.1.4实验方法

3.2结果与讨论

3.2.1盐析曲线和pH下降曲线

3.2.2盐析正交试验结果分析

3.2.3盐析单因素试验结果及分析

3.2.4透析单因素试验结果

3.3结论

参考文献

第四章离子交换层析纯化rhEGF

4.1材料与方法

4.1.1实验材料

4.1.2实验仪器

4.1.3分析方法：见2.3

4.1.4实验方法

4.2结果与讨论

4.2.1 PBS的pH对DEAE树脂静态吸附rhEGF的影响

4.2.2离子强度对DEAE静态吸附rhEGF的影响

4.2.3 DEAE树脂柱rhEGF穿透曲线及rhEGF动态交换容量

4.2.4 DEAE树脂柱高对rhEGF离子交换的影响

4.2.5进样与洗脱流速对rhEGF离子交换的影响

4.2.6进样体积与浓度对rhEGF离子交换的影响

4.2.7 DEAE离子交换逐次洗脱rhEGF曲线

4.2.8 DEAE离子交换柱的再生曲线

4.3结论

参考文献

第五章中等纯度rhEGF洗脱液的脱色

5.1材料与方法

5.1.1实验材料与仪器

5.1.2分析方法

5.1.3实验方法

5.2结果与讨论

5.2.1比色法检测色素的波长确定

5.2.2脱色树脂(剂)的选择

5.2.3色素在D314中的等温吸附曲线

5.2.4 D314脱色的穿透曲线与饱和色素吸附容量

5.2.5 D314树脂L9(37)脱色正交试验结果分析

5.2.6 D314树脂脱色单因素试验结果

5.2.7 D314树脂中色素洗脱曲线

5.3结论

参考文献

第六章中等纯度rhEGF冻干粉制造及质量指标

6.1材料与方法

6.1.1实验材料

6.1.2仪器与试剂

6.1.3分析方法见2.3

6.1.4实验方法

6.2结果与讨论

6.2.1 rhEGF真空冻干曲线

6.2.2 rhEGF冻干粉稳定保护剂的确定

6.2.3 rhEGF冻干粉质量指标

6.3结论

参考文献

第七章rhEGF在美容产品中的应用性研究

7.1材料与方法

7.1.1 rhEGF冻干粉的制备

7.1.2仪器与试剂

7.1.3分析方法

7.1.4实验方法

7.2结果与讨论

7.2.1 pH温度对rhEGF冻干粉水剂稳定性的影响

7.2.2 rhEGF使用浓度对美容效果影响

7.2.3 rhEGF与HA、丝蛋白的协同美容效果

7.2.4 rhEGF冻干粉水剂临床疗效比较

7.2.5三种含rhEGF美容化妆品使用效果

7.3结论

参考文献

第八章结论

致谢

研究生阶段发表/录用论文情况