腮腺炎病毒F蛋白七肽重复序列的结构生物学研究

摘要

腮腺炎病毒(MuV)同其他囊膜病毒相似,在融合蛋白(F)中具有两个七肽重复序列结构域(HR).有关其他囊膜病毒F蛋白的研究表明,HR区在F蛋白介导的病毒侵染中起着至关重要的作用,在结合蛋白或结合亚基的协助作用下,两段HR结构域的构像发生变化形成热稳定的富含α螺旋的发夹异源三聚体结构,并由此得到一个共同的融合机制.但目前并不清楚MuV是否有类似于其他囊膜病毒的侵染机制.该研究构建了HR区(HR1、HR2和2-Helix)的重组载体,并在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达了HR1、HR2和2-He1ix.GST融合的HR1、HR2和2-Helix单体蛋白都以可溶形式表达,利用亲和层析及凝胶过滤层析纯化获得了高纯度的目的蛋白.经pull-down实验,初步证实HR1和HR2之间存在相互作用,HR1和HR2的混合物在凝胶过滤层析中以聚体形式存在.HR1/HR2和2-Helix的化学交联实验表明,等摩尔的HR1和HR2可形成异源三聚体,其中2-Helix蛋白随着交联剂浓度的增加,呈现明显的单体和聚体的浓度梯度;HR1/HR2蛋白由于浓度较低虽未见清晰的单体和聚体的浓度梯度,但仍可看到明显的异源三聚体.凝胶过滤层析也证实了这一结果,两者在同一位置出峰,且在分子量为52 kDa和14.4 kDa的出峰位置之间,显示其以聚体形式存在.质谱分析结果显示,2-Helix蛋白分子量为11.7 kDa,HR1为7.1 kDa,HR2为4.7 kDa,2-Helix和HR1/HR2三体分子量分别为35.1 kDa和35.4 kDa,与凝胶过滤层析结果相对应.圆二色谱分析结果表明,单独的HR1以α螺旋结构存在,而HR2则以无规卷曲存在,当两者等摩尔混合后,α螺旋含量明显增加.2-Helix同样具有典型的α螺旋结构.2-Helix和HR1/HR2三体相当稳定,Tm达到76℃,而且这种结合是特异的,高温变性后的蛋白经低温长时间放置后能够大部分复性,仍然呈现较高含量的α螺旋结构.用晶体生长条件筛选试剂盒(Crystal Screen Ⅰ and Ⅱ,Hampton Research,Riverside,CA,USA)对2-Helix蛋白晶体的生长条件进行初选,经过优化最后在15%PEG 8000、1.0 M Li<,2>SO<,4>缓冲液长出可以进行衍射的晶体.通过应用程序AMORE,以SV5 F蛋白N1/C1三聚体晶体结构(PDB code:1SVF)为模型,利用分子置换的方法对2-Helix的晶体结构进行解析,得到了与SV5、RSV和NDV核心结构相似的六螺旋束,显示MuV可能具有与上述蛋白相似的融合侵染机制.

目录

致谢

1囊膜病毒融合蛋白研究现状及文献评述

1.1腮腺炎病毒概述

1.2囊膜病毒融合的分子机制

1.2.1病毒囊膜融合蛋白的一些基本特征

1.2.2流感病毒HA和HIV-1Env蛋白

1.3共同融合机制

1.4副粘病毒的融合机制

1.4.1副粘病毒简介

1.4.2副粘病毒的融合蛋白

1.4.3副粘病毒的融合机制

1.5存在问题、研究内容与目标

2腮腺炎病毒HR1、HR2及2-Helix基因载体构建

2.1材料与方法

2.1.1质粒与菌株

2.1.2 HR基因的引物设计

2.1.3构建载体

2.2结果与分析

2.2.1基因载体构建

2.2.2重组质粒的双酶切鉴定和测序

2.2.3重组质粒的表达鉴定

3 HR1、HR2及2-Helix蛋白的表达和纯化

3.1材料与方法

3.1.1重组载体在大肠杆菌中的表达

3.1.2表达蛋白产物的纯化

3.2结果与分析

3.2.1 pGEX-HR1、pGEX-HR2、pGEX-2-Helix都以可溶性蛋白的形式表达

3.2.2 HR1、HR2和2-Helix蛋白的初步纯化

3.2.3 HR1和HR2相互作用分析

3.2.4 2-Helix与HR1/HR2蛋白以多聚体形式存在

4腮腺炎病毒融合蛋白核心结构的二级结构分析

4.1材料和方法

4.1.1质谱分析

4.1.2化学交联

4.1.3圆二色谱分析

4.2结果与分析

4.2.1 2-Helix和HR1/HR2蛋白以三聚体的形式存在

4.2.2 2-Helix和HR1/HR2的α螺旋结构

5.蛋白2-Helix的结晶和结构解析

5.1材料与方法

5.1.1晶体生长条件的筛选

5.1.2晶体X射线衍射数据的收集和分析

5.1.3晶体结构的解析

5.2结果与分析

5.2.1蛋白2-Helix的结晶

5.2.2 2-Helix蛋白晶体X射线衍射数据的分析

6.问题与讨论

参考文献

附录1：MuV-HR1测序图

附录2：MuV-HR2测序图

附录3：MuV-2-Helix测序图

附录4：MuV-2-Helix mutation测序图

附录5：在读期间发表的研究论文