2-氯丙酸脱卤酶的分离纯化

摘要

2-氯丙酸(2-CPA)是合成农药、染料、农林和医药化学品等的重要原料，但是，由于2-氯丙酸具有光学活性，一般只有用(S)-构型2-氯丙酸合成的农药、医药等才具有很高的生理活性或药理作用，用(R)-构型合成的农药活性很低或无活性，且可能以竞争性抑制剂的形式起作用。而(R)-构型的2-氯丙酸在其它某些手性医药及其中间体的合成方面有很重要的应用，如可用于合成抗结核病药物硫乳霉素(thiolactomycin)。 2-氯丙酸脱卤酶有3种，分别为(S)-2-卤酸脱卤酶(EC3.8.1.2)、(R)-2-卤酸脱卤酶(EC3.8.1.9)、(R，S)-2-卤酸脱卤酶(EC3.8.1.10及EC3.8.1.11)。利用脱卤酶可选择性地高效拆分2-氯丙酸。 本文的研究目的是筛选对2-氯丙酸具有脱氯能力的菌株，并建立脱卤酶的分离纯化方法，从而为利用脱卤酶生产(S)-及(R)-构型光学活性2-氯丙酸奠定基础。 本文首先从杭州、温州、富阳等农药厂附近所采集的11个土样出发，筛选出了21支对2-氯丙酸具有脱卤活性的菌株。其中H9脱卤能力较强，S4和W20脱卤酶分别对(S)-2-CPA和(R)-2-CPA具有一定的选择性脱卤能力。 由于(R)构型脱卤酶的应用更为广泛，因此本文重点针对W20脱卤酶进行了分离纯化研究，经过盐析、脱盐、离子交换层析、凝胶层析后获得了电泳纯的脱卤酶，SDS-PAGE测定酶的分子量为35KDa。对部分酶学性质作了考察后发现，W20酶的最适反应pH值为10，最适反应温度为40℃。 最后对W20培养条件进行了考察。最佳培养基的碳源和氮源组合为葡萄糖和尿素。当碳源葡萄糖浓度为20g/L，氮源尿素浓度为1.0g/L时，可以获得较多的菌体和脱卤酶。对菌体的培养温度及培养pH进行考察，发现30℃是菌体生长较适宜的温度，pH7.0是菌体较适宜的培养pH值。

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

1.1手性及手性化合物的生物合成与拆分

1.1.1手性及手性化合物

1.1.2手性化合物的制备

1.1.3手性化合物的生物合成与拆分

1.2 2-氯丙酸简介

1.2.1 2-氯丙酸(2-Chloropropionic Acid，2-CPA)

1.2.2 2-氯丙酸的生产技术概况

1.2.3(S)-2-氯丙酸的用途及制备方法

1.2.4(R)-2-氯丙酸的用途及制备方法

1.3 2-氯丙酸脱卤酶及其产生菌简介

1.3.1α-卤酸脱卤酶

1.3.2 2-氯丙酸脱卤酶产生菌种的研究

1.3.3 2-氯丙酸脱卤酶产生菌种的筛选

1.4 2-氯丙酸脱卤酶的分离纯化概述

1.4.1层析分离

1.4.2 2-氯丙酸脱卤酶的分离纯化研究

1.5本文思路

第二章产2-氯丙酸脱卤酶产生菌种的筛选

2.1引言

2.2材料和方法

2.2.1试剂

2.2.2仪器

2.2.3培养基

2.2.4氯离子的测定

2.2.5产2-氯丙酸脱卤酶菌种的分离筛选

2.3实验结果与讨论

2.3.1 H系列菌株筛选

2.3.2 W系列菌株筛选

2.3.3 F系列菌株筛选

2.3.4 S系列菌株筛选

2.4本章小节

第三章脱卤酶的分离纯化

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1材料和设备

3.2.2实验方法

3.3实验结果与讨论

3.3.1 H9、F19、S4、W20产酶部位考察

3.3.2 H9粗酶考察结果

3.3.3 F19粗酶考察结果

3.3.4 S4粗酶考察结果

3.3.5 W20酶考察结果：

3.4小结

第四章脱卤酶产生菌W20培养条件考察

4.1引言

4.2材料和方法

4.2.1试剂

4.2.2方法

4.3实验结果

4.3.1碳源考察

4.3.2氮源考察

4.3.3碳源和氮源组合考察

4.3.4碳源浓度考察

4.3.5氮源浓度考察

4.3.6培养温度的考察

4.3.7培养pH值的考察

4.4小结

第五章结论与建议

5.1结论

5.2建议

附录1 W20脱酶脱盐图

附录2 W20脱卤酶离子交换层析图

附录3 W20脱卤酶凝胶层析图

参考文献

致谢