静电相互作用主导的双水相胶束系统研究

摘要

双水相分配技术的研究近来出现了新的动态，其中以聚皂构成的双水相胶束系统比较突出，其分配推动力主要来自于静电相互作用。本文针对双水相胶束系统的特点及应用前景作了较为全面的分析，论文对下列三方面内容展开研究：疏水季铵化改性聚氧乙烯(HyaminemodifiedHM-EO)的制备及测定方法、HM-EO及其季铵化改性聚合物的胶束性质及液液平衡性质和利用这类聚合物构成的双水相胶束系统分离蛋白质的基础及应用研究。 采用HM-EO的丙酮-水溶液与过量的卤烷(CH3Br、CH3CH2Br和n-CH3(CH2)3Br)在低温搅拌、超声波条件下进行亲核取代反应，制备得到季铵型疏水改性聚氧乙烯N-R-HM-EO[R=CH3(Me)，CH3CH2(Et)，n-CH3(CH2)3(n-Bu)]。建立了以丙酮为助溶剂，以考马斯亮蓝G250为显色剂的分光光度法，快速准确地测定了HM-EO及其季铵化改性聚合物的浓度，确定了分光光度法的显色剂用量及显色反应时间。研究表明，常见无机盐如NaCl，KBr和Na2SO4及待测液的pH值对该方法无干扰，而小分子表面活性剂如SDS的加入对该方法有较大的干扰，该方法准确度与精密度均高于重量法。 为了更好地了解聚皂类双水相胶束系统的相行为和电化学分配的影响因素，本文采用荧光探针法对HM-EO及其季铵化改性聚合物的胶束性质进行了研究。季铵型HM-EO由于其离子头基比叔胺型HM-EO更易电离，带电性增强，其临界胶束浓度(CMC)高于叔胺型HM-EO，胶束聚集数则少于叔胺型HM-EO。考察了盐效应、溶液pH值和温度对四种聚皂形成胶束性质的影响，结果表明盐浓度增加，胶束的双电层压缩，使胶束离子头基之间静电斥力作用减弱，胶束中疏水基团排列更为紧密，胶束的聚集数增加，聚皂的CMC下降；溶液pH值对叔胺型HM-EO形成的胶束影响显著，而对季铵型HM-EO形成的胶束性质影响不大；随着温度的增加，四种聚皂的CMC下降，聚皂的胶束聚集数也略有增加。考察了HM-EO与SDS混合物在纯水溶液中的胶束性质，SDS的离子头基与HM-EO中表面活性结构单元可形成混合胶束，混合胶束的性质取决于胶束中SDS分子与HM-EO表面活性结构单元结构的比例以及胶束的聚集数。 研究了HM-EO及其季铵化改性聚皂形成的双水相胶束系统的液液相平衡性质，随着pH值的增加，HM-EO-缓冲液系统的两相区域逐渐变大，而HM-EO季铵化改性聚合物形成的双水相系统两相区域变化程度很小。溶液中盐浓度的增加有利于双水相系统的形成，与叔胺型聚合物相比较，盐离子对季铵型聚皂胶束之间的静电作用的影响更强，对其相图的影响也更为显著。考察了不同阴离子和阳离子在相同浓度下对系统相图的影响。阴离子对增大HM-EO-H2O双水相两相区域的作用次序为：SO42-＞F-＞Cl-＞Br-＞I-；阳离子的作用次序为：K+＞Na+。考察了HM-EO与SDS形成的混合双水相胶束系统的相行为，随着SDS加入量的增加，SDS和HM-EO在上下两相中的浓度差均逐渐减小，直至空间网状结构的解体及双水相系统的消失。 分别考察了两种模型蛋白BSA和溶菌酶在等电点和pH7.0时双水相胶束系统中的分配情况，结果表明等电点时模型蛋白主要受疏水相互作用及体积排阻作用等因素而主要分配于上相；在pH均为7.0的系统中，静电相互作用较大的系统是HM-EO/SDS和N-Me-HM-EO-缓冲液系统，相对而言，N-Me-HM-EO-缓冲液体系是一种较理想的静电作用力主导的双水相系统。考察了系统pH、电导率及温度对模型蛋白在HM-EO-缓冲液、HM-EO/SDS和N-Me-HM-EO-缓冲液系统中分配的影响，结果表明pH决定了模型蛋白的电性及带电量，因而对分配的影响显著；系统的电导率在一定条件下与系统中的离子强度呈正相关，较低的离子强度对保持较强双水相胶束系统中的静电相互作用有利，实验选用系统的电导率为2.0mS/cm左右；较高的分配温度有利于系统中聚皂胶束的形成，从而加强聚皂胶束与蛋白质之间的静电相互作用，但会造成一定的酶活损失，为了获得较高的酶活回收率，分配实验所选用的分配温度为10～25℃。考察了SDS加入量对模型蛋白在HM-EO/SDS系统中分配行为的影响，结果表明，当系统中SDS的浓度为0.1％(w/w)时，两种模型蛋白均达到了最佳的分配效果。采用Kamei等的分配模型描述了N-Me-HM-EO-水系统中的静电相互作用，验证了两种模型蛋白的电化学分配系数，并与实验值进行了比较，结果表明模型计算值与实验值符合较好。 研究了P450BM-3在N-Me-HM-EO-缓冲液体系统中的分配行为，优化了双水相分配的条件，通过不同pH时破胞液中P450BM-3及杂蛋白的分配情况，确定了两步双水相萃取法分离P450BM-3的工艺。结果显示，经第一步分配(pH8.0系统)后，P450BM-3的酶活回收率为86.3％，但纯化倍数仅为1.22，仅除去少量杂蛋白，而经透析及第二步分配后，纯化倍数提高到2.54，酶活回收率下降到73.3％。进行了实验室规模放大分配实验，采用pH6.0系统一步分配，系统放大倍数为10倍，P450BM-3的分配系数(Ke)为11.62，酶活回收率为75.8％，纯化倍数为1.92。 本文从疏水改性聚氧乙烯的季铵化改性出发，对四种聚皂的胶束性质及由它们形成的双水相胶束系统进行了系统地考察。在模型蛋白分配的研究基础上，将新型双水相胶束系统用于从细胞破壁液中分离提取P450BM-3，实现了制备、基础物性，分配和应用的研究路线，研究成果为进一步开发以聚皂为成相剂的双水相胶束系统奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

1.1生物下游加工技术的特点及现状

1.2双水相分配技术介绍及其研究进展

1.2.1双水相系统的分类

1.2.2双水相系统的成相机理

1.2.3双水相萃取系统的特点

1.3疏水改性水溶性聚合物

1.3.1疏水改性水溶性聚合物的化学结构

1.3.2疏水改性聚合物在水溶液中的分子间相互作用

1.3.3聚皂性质及研究方法进展

1.4双水相胶束系统研究进展

1.4.1双水相胶束系统的特点及应用前景

1.4.2双水相胶束系统的生物相容性

1.4.3双水相胶束系统中的分配平衡理论

1.5双水相系统中的静电相互作用

1.5.1蛋白质的电化学性质

1.5.2双水相系统中静电相互作用的强化

1.6研究思路和目标

参考文献

第二章疏水季铵化改性聚氧乙烯的制备及定量方法

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2主要试剂

2.2.3仪器与设备

2.2.4方法

2.3结果与讨论

2.3.1测定方法的可行性分析

2.3.2显色剂用量及显色时间的确定

2.3.3聚合物含量的测定方法

2.3.4无机盐对标准曲线的影响

2.3.5 pH的影响

2.3.6 SDS对标准曲线的影响

2.3.7测定方法的准确度与精密度

2.4小结

参考文献

第三章疏水改性聚合物的胶束性质

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2主要试剂

3.2.3仪器与设备

3.2.4方法

3.3结果与讨论

3.3.1荧光发射光谱测定条件的确定

3.3.2四种聚皂在纯水中的胶束性质

3.3.3盐效应对聚皂胶束性质的影响

3.3.4 pH对聚皂胶束性质的影响

3.3.5温度对聚皂胶束性质的影响

3.3.6 HM-EO与SDS混合物的胶束性质

3.4 小结

参考文献

第四章双水相胶束系统的液液相平衡性质

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1材料

4.2.2主要试剂

4.2.3仪器与设备

4.2.4方法

4.3结果与讨论

4.3.1 pH对双水相胶束系统相行为的影响

4.3.2无机盐浓度对相图的影响

4.3.3盐离子种类对相图的影响

4.3.4 HM-EO/SDS双水相系统

4.4小结

参考文献

第五章模型蛋白在双水相胶束系统中的分配

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1材料

5.2.2主要试剂

5.2.3仪器与设备

5.2.4方法

5.3结果与讨论

5.3.1五种不同双水相胶束系统的比较

5.3.2聚合物浓度与蛋白质浓度对分配的影响

5.3.3缓冲液的选择

5.3.4 pH对分配的影响

5.3.5电导率对分配的影响

5.3.6温度对分配的影响

5.3.7 SDS浓度对分配的影响

5.3.8混合蛋白质溶液的分配

5.3.9双水相胶束系统的分配模型

5.4 小结

参考文献

第六章双水相胶束系统分离细胞色素P450BM-3的研究

6.1前言

6.2材料与方法

6.2.1材料

6.2.2主要试剂

6.2.3仪器与设备

6.2.4方法

6.3结果与讨论

6.3.1破胞液加入量对P450BM-3分配的影响

6.3.2 pH对P450BM-3分配的影响

6.3.3缓冲盐浓度对P450BM-3分配的影响

6.3.4两步双水相萃取法分离纯化P450BM-3工艺

6.3.5实验室规模放大实验

6.3.6与其它纯化工艺的比较

6.3.7双水相胶束系统的分配方案及局限性

6.4小结

参考文献

第七章结论与建议

7.1结论

7.2建议

缩略语表

致谢

发表论文情况