猪主要病毒性疾病病原的分子检测技术研究

摘要

随着我国现代化畜牧业的发展，养猪产业的集约化、规模化程度愈来愈高，生猪及其产品的流通日益频繁，流动范围进一步加大，猪传染病的发生与流行有加重的趋势。多病原混合感染和继发感染已成为当今猪群发病的普遍规律。免疫抑制性病毒，如猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪圆环病毒2型等，是目前危害养猪业的不可忽视的原发性病原，与其他病原混合感染后可导致猪群的高发病率和高死亡率，使临床诊断的难度大大增加。随着对各种病毒基因组分子生物学研究的不断深入，一系列基于核酸的病原检测技术不断出现，为疾病的诊断提供了实用快速的新方法。 本文针对猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因保守序列设计引物与TaqMan探针，在建立常规PCR的基础上，设计并优化了TaqMan荧光定量PCR方法用于PRRSV核酸的检测。建立的荧光定量PCR方法与其它猪主要病原之间无任何非特异性反应；针对阳性克隆质粒的检测灵敏度可以达到1.2×10<'1>copy/ml，比常规PCR高100倍；通过对48份临床疑似样本的检测表明有29份样本为PRRSV阳性，而常规PCR只能检出其中19份阳性样本。上述结果表明，实验建立的PRRSVTaqMan荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，提供了一个更为有效的PRRSV临床检测方法。 针对猪圆环病毒2型ORF2、猪伪狂犬病毒gD和猪细小病毒VP2基因保守区域，设计了特异性引物，在分别建立单一病毒基因PCR检测方法的基础上，通过对三组引物的比例和浓度、dNTPs和Mg<'2+>的浓度、退火温度等条件的优化，建立了针对上述3种病毒的三重PCR检测方法。敏感性试验表明，应用该方法最低可检测到4×10<'-4>ng/μl的PRV双链DNA模板和2×10<'-5>ng/μl的PCV-2和PPV单链DNA模板。经对50份自然感染病猪样品检测结果表明，该三重PCR检测结果与单一PCR．检测结果符合率达到96％，试验结果提示，建立的三重PCR检测方法可用于3种DNA病毒的同时检测，具有快速、准确的特点，有临床应用前景。 采用建立的PCR检测系统对浙江省11个地区190份送检病料进行PRRSV、PCV-2、PRV、PPV等4种病原的基因检测，结果表明PRRSV和PCV-2感染率较高，分别达到了38.9％和30.53％，PRV和PPV感染率相对较低，分别为5.8％和3.7％。多病原混合感染率为15.26％，其中以PRRSV和PCV-2混合感染为居多(75.86％，22/29)。目前PRRSV和PCV-2仍是呼吸和繁殖系统障碍、高热症的主要病原。

目录

摘要

第一部份 文献综述

第一章猪主要病毒性疾病的流行概况

1.猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)

2.猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)

3.猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)

4.细小病毒(Porcine parvovious,PPV)

第二章PRRSV、PCV-2、PRV、PPV的病原学特征

1.PRRSV的病原学特征

2.PCV-2的病原学特征

3.PRV的病原学特征

4.PPV的病原学特征

第三章基于核酸的病原检测技术

1.核酸探针技术(Nucleic Acid Probe)

2.聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)

3.多重PCR(Multiplex PCR,mPCR)

4.多聚酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism,RCR-RFLP)

5.荧光定量PCR(Real-time PCR)

第二部分 研究内容

第四章PRRSV荧光定量PCR检测方法的建立

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第五章PCV-2、PRV和PPV三重PCR检测方法的建立

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第六章PCR体系在临床病料检测中的应用

1.材料和方法

2.结果与讨论

附录

致谢