问号钩端螺旋体主要外膜蛋白免疫功能表位及其致炎作用的研究

摘要

钩端螺旋体(简称钩体)病是由问号钩体感染引起的自然疫源性人兽共患传染病，人类主要通过接触带菌动物尿液污染的水体、土壤而感染。因此钩体病也是洪涝时重点监控的传染病。严重者可导致Weil's综合症。虽然钩体病的致病因素如：脂多糖、脂蛋白、肽聚糖、热休克蛋白及鞭毛蛋白等可能与致病性有关，但确切的致病机制至今未明。 钩端螺旋体属可分为问号钩体和双曲钩体，前者为致病菌，后者则为腐生型。钩体血清群、型众多，各群、型间交叉保护作用较弱或无，故目前国内外均采用当地流行的钩体血清群、型来制备多价钩体疫苗菌苗，但副作用较大，交叉免疫保护作用微弱。 近年我国科学家报道了问号钩体黄疸出血群赖型赖株的全基因序列，国外学者报告跨膜蛋白OmpL1、脂蛋白LipL32和LipL41是所有问号钩体外膜中主要的表面蛋白。我们曾证实我国流行的问号钩体参考标准株均含有编码上述外膜蛋白的ompL1、lipL32和lipL41基因，其重组表达产物具有良好的抗原性和免疫反应性。然而，OmpL1、LipL32和LipL41可能的抗原表位，及其诱导细胞分泌炎性细胞因子的作用未见报道。 本研究中，我们建立了Ni-NTA亲和层析法，并提取了不同基因型表达的重组目的蛋白(rOmpL1/1和rOmpL1/2、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2)，以SDS-PAGE鉴定表达产物，采用多种预测服务器对表达产物分子的功能表位进行了分析，并以人脐静脉内皮细胞株EVC-304为效应细胞，检测了上述重组蛋白诱导细胞分泌炎性细胞因子的作用。 1材料和方法1.菌株和细胞株：问号钩体ompL1/1和ompL1/2、lipL32/1和lipL32/2、lipL41/1和lipL41/2基因型原核表达系统由本实验室提供。人脐静脉内皮细胞株EVC-304购自中国科学院上海细胞生物学研究所，培养基为含10％胎牛血清的RPMI1640。 2.目的蛋白的表达和鉴定：将上述工程菌株接种于BL培养基中，30℃300r/min振荡培养至OD600为0.6～0.8，加入0.25mmol/LIPTG，30℃300r/min振荡培养约4h，诱导细菌表达目的重组蛋白。10000r/min离心15min收集细菌沉淀，用灭菌蒸馏水重悬，300V、5S×5超声破碎。利用表达产物中6×His标签，以Ni-NTA亲和层析柱(Biocolor)收集并纯化目的蛋白。采用10％SDS-PAGE检测目的蛋白表达和提纯情况。 3.信号肽、MHC-Ⅱ类分子结合肽和B细胞表位分析：蛋白质一级序列由本实验室提供。信号肽分析采用TechnicaluniversityofDenmarkdtu提供的预测服务器SignalP3.0版本SignalP-NN软件，MHC-Ⅱ类分子结合肽和B细胞表位分析分别采用InstituteofMicrobialToechnology,Chandigarh,India提供的预测服务器PropredMHCclass-Ⅱbindingpeptideprediction-ProPred和EMBOSS软件包中ANTIGENIC程序。 4.炎性细胞因子的检测：96孔细胞培养板中每孔加入5×103个EVC-304细胞，在5％CO2、37℃条件下预培养24h。分别用2％胎牛血清RPMI1640配制的不同浓度rOmpL1/1和OmpL1/2、LipL32/1和rLipL32/2、LipL41/1和rLipL41/2溶液换液，使上述6种重组蛋白的终浓度分别为每孔1和10μg，各重组蛋白的不同作用浓度均设置3个复孔。培养板于5％CO2、37℃条件下分别培养24和48h。收集上清液，用ELISA检测试剂盒(TPI)按操作说明书分别检测IL-1α、IL-8和TNF-α的OD490值。试验中分别以每孔0.1μg的重组TNF-α商品(SibEnzyme)和2％胎牛血清的RPMI1640为阳性对照和阴性对照。根据试剂盒所提供的IL-1α、2IL-8和TNFα标准品及操作说明书，以OD490值为纵坐标、各细胞因子标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，并用Excel软件获得各细胞因子浓度计算公式。 5.数据分析：采用SPSS9.0软件，对OmpL1/1和OmpL1/2、LipL32/1和LipL32/2、LipL41/1和LipL41/2诱导EVC-304细胞分泌炎性细胞因子的检测结果进行t检验分析。结果1.信号肽序列及切割位点：OmpL1s、LipL32s和LipL41s的N端1～21或1～24位氨基酸构成信号肽，切割位点在N端的第21～22或24～25位。 2.MHC-Ⅱ类分子结合肽和B细胞表位：OmpL1s、LipL32s和LipL41s能与半数以上目前已知51个MHC-Ⅱ等位基因的结合肽段分别有3、3和1个，但同时与B细胞结合的重叠表位分别为3、2和1个。 3.目的蛋白的表达产量及产物纯度：SDS-PAGE检测结果表明，rOmpL1/1和rOmpL1/2、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2的表达产量分别约占细菌总蛋白的30％和15％、40％和35％、15％和10％，经Ni-NTA亲和层析法提取的目的蛋白SDS-PAGE后均仅见单一的蛋白条带。 4.OmpL1s、LipL32s和LipL41s诱导内皮细胞分泌炎性细胞因子的作用：IL-1α、IL-8和TNFα浓度计算公式分别为yIL-1α=46.51X-6.32、yIL-8=42.46X-3.50和yTNFα=362.64X-24.79。1和10μg的OmpL1s、LipL32s和LipL41s均可明显促进人静脉内皮细胞株EVC-304合成并分泌IL-1α、IL-8和TNF-α(P＜0.05)，且同一基因不同基因型表达产物作用效果相似(P＞0.05)。其中IL-1α以作用24h时最高，然后下降；IL-8和TNF-α则随作用时间延长而3逐渐升高。上述不同基因产物中，诱导细胞分泌炎性细胞因子活性强弱依次为OmpL1s、LipL41s和LipL32s。 结论1.本研究表明ompL1/1和ompL1/2、lipL32/1和lipL32/2、lipL41/1和lipL41/2基因型原核表达系统是高效原核表达系统； 2.建立了可快速获得高纯度目的重组蛋白的Ni-NTA亲和层析法； 3.问号钩体ompL1/1、lipL32或lipL41不同基因型的表达产物均存在相似的MHC-Ⅱ类分子结合肽和B细胞表位； 4.建立了钩体主要外膜蛋白对静脉内皮细胞的致炎模型； 5.rOmpL1/1和OmpL1/2、LipL32/1和rLipL32/2、LipL41/1和rLipL41/2对EVC-304细胞均有直接的致炎作用。

目录

前 言

第一部分信号肽、MHC-Ⅱ类分子结合肽和B细胞表位分析

第二部分目的蛋白的表达及产物纯化

第三部分OmpL1s、LipL32s和LipL41s诱导内皮细胞分泌炎性细胞因子的作用

讨 论

参考文献

钩端螺旋体致病机制研究进展

攻读硕士期间的研究成果

致谢