真核翻译起始因子3第4亚单位（eIF3g）在肿瘤细胞多药耐药中的作用

摘要

肿瘤细胞的耐药现象尤其是多药耐药(multidrug resistante,MDR)是导致临床化疗失败的重要因素之一.迄今人们已从很多方面对肿瘤细胞的耐药机制进行了大量研究,如P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)等ATP结合型(ATP bindingcassette,ABC)细胞膜转运蛋白对药物外排而导致细胞内药物的有效浓度降低、谷胱甘肽巯基转移酶类(glutathione S transferase,GST)对细胞内药物的解毒、DNA拓扑酶类(DNA topoisomerase)的表达及活性降低使细胞对药物的敏感性改变、细胞内DNA修复机制的影响以及细胞色素P450等(cytochrome P450)表达下降使其对药物的活化作用下降等.另外许多研究还表明,细胞内HSPTO等应激蛋白的表达升高一类的抗凋亡因素也与肿瘤细胞耐药有关.这些耐药机制的发现与研究都给临床问题的解决提供了清晰的思路和明确的靶点,并已有了一些针对性措施,而且也收到了相应的疗效,如针对P-gp的一种MDR逆转剂维拉帕米(verapamil),可以有效地抑制P-pg介导的药物外排而使高表达P-gp的肿瘤细胞对化疗药物变得敏感.但是肿瘤细胞的耐药是由众多因素影响的,原因十分复杂,而人们对这些因素的认识远未达到全面的程度,因此仍无法完全解决临床肿瘤耐药问题.人们仍在从各个方面对肿瘤耐药机制进行更多的探索性研究,如整合素(integrin)和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)相互作用导致的MDR现象.因此,探寻更多的肿瘤细胞耐药相关因素,全面透彻地阐明耐药的机制,可以使我们有更多的、更有效的解决临床化疗耐药问题的手段,具有十分重要的理论和临床应用意义. 为了从整体水平寻找新的肿瘤细胞耐药/MDR相关因素,我们课题组在前期工作中,模拟临床状态,将人白血病细胞株K562培养于含阿霉素(adriamycin,ADR)的培养液中,通过长时间递增剂量ADR的诱导,成功地获得了稳定的具有MDR表型的多药耐药系K562/ADR,至今已六年余.该细胞系可常规培养于含有ADR的培养液中,与对药物敏感的母细胞株K562相比,K562/ADR对ADR的耐受性增加了约149倍;对长春新碱的耐受性增加了200倍以上.在此基础上,我们运用了蛋白质双向电泳技术结合质谱分析,研究了Ka62/ADR细胞和K562细胞在蛋白质表达上的差异.蛋白质双向电泳图谱表明,K562/ADR细胞与K562细胞相比,既有一些蛋白质表达的明显的量上的差异,又有一些蛋白质从无到有或从有到无的表达改变,这些蛋白质表达情况的变化,是人白血病细胞K562从对药物敏感到接触到化疗药物ADR后产生多药耐药特性这一变化中细胞内一系列分子事件的直接体现,是MDR表型产生的分子基础.我们对其中一个在K562细胞中无表达、但在K562/ADR细胞中大量表达(考马斯亮蓝染色和银染)的蛋白质进行了进一步的串联质谱(MS-MS)分析,鉴定为真核翻译起始因子3第4亚基(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit 4,eIF3g),根据国际命名规则为eIF3g. eIF-3是最大最复杂的真核翻译起始因子,包含至少12个亚单位,有a(p170,p150,eIF3s10)、b(p116,eIF3s9)、c(p110)、d(p66,eIF3s7)、e(p48,int6)、f(p47)、g(p44,p42,eIF3g)、h(p40,eIF3s3)、i(p36)、j(p35,eIF3s1)、k(p28)、1(p69)等.在翻译起始过程中,eIF-3在形成43S起始前复合物(preinitiationcomplex)及引导mRNA正确结合中起协调作用.但到目前为止,对eIF3的各个蛋白亚单位的具体功能还未完全了解. 已有的研究表明,在人乳腺癌,子宫颈癌,胃癌,食道癌和肺癌中,eIF-3最大的一个亚单位eIF3a/p170/p150的表达显著提高,表达水平与临床病理类型相关,并且其高表达可能是一个恶变早期的指标,并可能在癌细胞的生长、恶性生物学行为的维持上起重要的作用.eIF-3的另一个亚单位eIF3h/p40在一些前列腺癌和原发性乳腺癌中也呈现出高表达的情况.而eIF3e/int6也被认为可作为判断非小细胞肺癌中病人预后的一个指标.更重要的一个发现是,在对模式生物酵母菌的研究中有迹象表明eIF3的一个蛋白亚单位eIF3e/int6在真核细胞的耐药中发挥了作用. 本课题的研究对象是eIF3的另一个亚单位eIF3g，目前人们除了对它在翻译起始过程中的作用有少量的了解，尚未有文献报道其与包括肿瘤在内的任何人类疾病相关。为了研究eIF3g与肿瘤细胞多药耐药之间的关系，本课题克隆了eIF3g全长编码区cDNA,构建了eIF3g原核细胞GST融合蛋白表达载体，回收了融合蛋白作为抗原制备多克隆抗体;构建了(His)a-eIF3g表达载体，并在Bcap37细胞得到稳定表达;构建了 EGFP-eIF3g表达载体，观察了eIF3g的亚细胞定位情况. 结论: 1.在大肠杆菌中表达eIF3g重组蛋白并以此为抗原成功获得兔抗血清. 2.建立稳定的eIF3g高表达Bcap37乳腺癌细胞系,为进一步研究eIF3g与肿瘤细胞多药耐药相关性打下了基础. 3.eIF3g不仅在细胞质有分布,而且可以进入细胞核并在细胞核中聚集.

目录

前言

第一部分eIF3g全长编码区cDNA的克隆

第二部分eIF3g GST融合蛋白的表达与兔抗血清的制备

第三部分eIF3g pcDNA4/HisMaxB表达载体的构建及在乳腺癌细胞Bcap37的表达

第四部分eIF3g-EGFP融合蛋白表达载体的构建及亚细胞定位情况

讨论

结论

创新点

参考文献

综述真核翻译起始因子与肿瘤

附录在学期间发表论文

致谢