油菜（Brassica napus L.）EST-SSR标记的开发及应用研究

摘要

数量急剧增加的EST(expressed seqLlence tags)为分子标记的开发提供了宝贵的资源。与来自于基因组DNA开发的传统标记相比，以EST为基础的分子标记是一种新型分子标记，具有其显著的优势，如开发简便、信息量高和通用性好等，在多方面都有重要的利用价值例如在比较作图、遗传多样性评价及系统发育学等方面的研究。然而，目前在许多物种中此类新型的分子标记尚未得到开发利用。 油菜作为重要的油料作物之一，随着分子生物学在作物育种上的应用，在众多研究者的努力下，已有了大量的以基因组为基础的分子标记技术应用于其中，为培育油菜新品种、提高产量、改善品质、增强抗性和遗传研究提供了空前的发展机遇。但目前未有研究者对油菜的EST资源进行开发以及利用。 本研究以油菜EST的数据为基础，分析了其中SSR序列的资源，进行了初步实验建立了部分EST-SSR标记，并对这些标记在油菜的遗传背景分析中进行了尝试性地应用。为油菜育种的研究在分子水平上提供了一些信息参考。实验结果如下： (1)从NCBI公共数据库获得63334条油菜EST，通过前处理得到全长为12165.38kb的无冗余EST17987条。共在这些序列中搜索出2803个SSR，分布于2443条EST中，出现频率是15.58％。这些EST-SSR的平均长度为18.84bp，平均分布频率是1/4.34kb。二核苷酸重复和三核苷酸重复是主要的类型，二者出现的频率基本相近，占总SSR的近89.05％。AG/CT和AAG/CTT是二、三核苷酸中的优势重复类型，分别占二、三核苷酸重复的84.04％和35.71％。 (2)以2083个EST-SSR为基础进行标记建立，设计了23对SSR引物，通过梯度PCR试验确定了各引物的适宜退火温度，并利用非变性聚丙烯酰胺凝胶银染对这些引物在10个油菜品种中的扩增情况和多态性进行了检测。有21对引物显示扩增，引物可用率为91.30％；有12对引物显现出多态性，占可扩增引物的57.14％。证明了根据油菜EST建立SSR标记是有效、可行的。 (3)利用这些开发得到的21个油菜EST-SSRs标记检测42个油菜品种(系)的遗传多样性，对其进行了遗传背景分析。共检测到85个等位位点，其中有49个等位变异，占了总检测位点的57.65％。借助NTSYS软件的聚类方法分析，结果表明：42份材料遗传距离范围为0.0087-0.3190，在遗传距离0.1508下，可把份材料分为5组，基本反映了品种(系)的地源差异，同时为油菜育种的亲本选择提供科学依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

致谢

项目流程图

第一章文献综述-EST分子标记开发及在基因组学的应用

1 EST分子标记的类型及特点

2 EST标记的开发策略

2.1 EST数据的取得与前期处理

2.2 EST聚类

2.3各类EST标记的开发

3 EST标记在比较基因组学研究中的应用

3.1比较作图研究

3.2遗传多样性评价

3.3系统发育学研究

4 EST在基因功能研究上的应用

5结束语

参考文献

第二章油菜EST资源的SSR信息分析

1材料和方法

1.1油菜EST来源

1.2 EST前处理

1.3去冗余——聚类

1.4聚类拼接序列的注释

1.5 SSR筛选

2结果和分析

2.1油菜EST中出现SSR的频率

2.2油菜EST-SSR的特性

2.3油菜EST-SSR的可用性评价

3讨论

参考文献

第三章油菜EST-SSR标记的建立

1材料和方法

1.1植物材料与模板DNA的提取

1.2 EST中SSR序列的获得

1.3 EST-SSR引物设计

1.4退火温度的测试

1.5非变性聚丙烯胺凝胶的制备

1.6电泳分离

1.7银染

2结果与分析

2.1退火温度的确定和引物筛选

2.2 EST-SSR标记的多态性

3讨论

参考文献

第四章EST-SSRS检测油菜亲本遗传多样性

1材料与方法

1.1供试材料

1.2样本DNA的提取

1.3 PCR体系的建立

1.4非变性聚丙烯胺凝胶的配制

1.5电泳分离

1.6银染

1.7统计分析

2结果与分析

2.1 SSR标记多态性分析

2.2 SSR标记聚类结果

讨论

参考文献

附录