人卵泡发育超微结构、基因表达谱的研究及未成熟卵体外培养的临床应用

摘要

对卵母细胞和卵泡发育、成熟机制的研究是人类揭示自身繁衍的奥秘、提高人口素质的需要.自从20世纪30年代以来,随着物理化学技术,尤其是电子显微镜技术的发明和分子生物学技术的不断发展,打破了光学显微研究细胞的局限而进入了超微结构和分子生物水平的领域,为包括生殖细胞的来源、原始生殖细胞分化、始基卵泡由静止池进入生长发育阶段的动因、初级卵泡发育为次级卵泡和成熟卵泡过程的形态学变化规律和内分泌环境、自分泌和旁分泌作用等研究提供了技术平台. 在卵泡/卵母细胞的发育过程中卵巢局部的微环境参与了整个过程,有研究发现卵泡颗粒细胞产生的抑制素A、抑制素B和激活素A是卵母细胞成熟基本细胞因子,胰岛素样生长因子Ⅰ/Ⅱ、表皮生长因子、转化生长冈子、骨形成蛋白、生长与分化冈子、肿瘤坏死因子、白介素、抗苗勒管激素、卵细胞成熟抑制因子、有丝分裂原激活蛋白激酶、促成熟因子、连接蛋白43、生长与分化激素、妊娠相关血浆蛋白a、血管上皮生长因子、磷脂酰肌醇3激酶(P13K)等对卵母细胞/卵泡发育的启动、生长、成熟起着极为重要的作用,当上述物质缺失或编码基因突变将导致卵细胞或卵泡发育、成熟障碍.虽然已明确了卵泡发育的基本形态学改变和FSH、LH、T、E<,2>等激素的周期性变化,并对影响卵母细胞成熟的卵巢内微环境冈素的研究取得了一定的进展,尝试在卵母细胞体外成熟培养中添加上述的某些物质,但仍未达到生理状态的成熟.卵池/卵母细胞发生、发育、成熟过程极为复杂,包含其中的分子可能有数十种、数百种、甚至数千种?由于卵泡壁层颗粒细胞、膜细胞、卵丘颗粒细胞和卵母细胞之间众多生长因了、细胞因子的相互调节作用机制仍未完全清楚,对于ART及其衍生技术的不断涌现,卵泡和卵母细胞受超生理剂量的促性激素和性激素的影响以及在体外培养过程中的一系列超微结构的形态学变化更缺乏了解.因此,我们试图从未成熟卵泡和成熟卵泡颗粒细胞基因表达差异、卵细胞超微结构形态的改变研究卵母细胞、卵泡生长、发育、成熟机制,分析参与卵母细胞/卵泡成熟的相关因素,获取卵母细胞成熟的相关信息,为建立合理的IVM体系提供理论支持,探索未成熟卵获取周期准备方案、取卵时机和体外培养条件. 一、人未成熟卵和成熟卵卵丘复合物超微结构研究 目的：观察人卵丘复合物(oocyte-cumulus complex,OCCs)在体内和体外从未成熟发育至成熟的超微结构变化,并比较自然状态和常规促排卵IVF/ICSI周期未成熟OCCs超微结构的区别,分析不同条件和环境对卵细胞质量的影响. 方法: 用光镜分辨生发泡期(GV期)、生发泡破裂期(M Ⅰ期)的米成熟卵和达到M Ⅱ期的成熟卵.标本来自妇科腹腔镜手术的自然周期、IVF/ICSI周期、IVM周期捐赠的卵丘复合物(OCCs).对妇科腹腔镜手术的自然周期未成熟卵(GV期)、促排卵周期未成熟卵(GV/MI)、促排卵周期体内成熟卵(MII)、体外成熟培养成熟卵(MII)各3枚,分别经透射电镜技术处理,观察OCCs的超微结构. 结论： 1.经常规促排卵的IVF/ICSI周期,在大部分卵母细胞成熟的情况下产生的GV期卵丘复合物,由于受超生理剂量FSH以及hCG的影响,卵丘细胞与卵母细胞连接松散,将导致卵母细胞过早缺乏颗粒细胞通过缝隙连接输送的营养以及卵母细胞皮质颗粒过早出现,可能是受精率和胚胎发育能力下降的原因.超生理状态的激素环境将影响发育延迟卵母细胞体外成熟的能力.因此,来自于常规促排卵周期的GV卵不适合进一步的培养,用于胚胎移植. 2.促排卵周期MI期卵丘细胞呈旺盛的增殖和功能活动状态,卵母细胞内的胞质结构、皮质颗粒、透明带等已发生了适合于卵母细胞成熟的显著的形态学改变,为卵母细胞成熟做好的充分的准备,具有进一步发育的潜能. 3.经体外成熟母细胞滑面内质网扩张,线粒体数目减少、结构模糊,脂滴减少,皮质颗粒减少,而且卵丘颗粒细胞凋亡改变明显,可能是卵母细胞质量下降、使其进一步发育能力受损的原因. 二、人类未成熟卵泡和成熟卵泡颗粒细胞基因表达差异 目的：分析人未成熟卵泡和成熟卵泡颗粒细胞基因表达差异,探讨卵泡颗粒细胞在卵泡/卵母细胞成熟过程中可能参与的分子机制. 方法:获取IVM周期未成熟卵泡(直径5～12mm)的卵泡液和常规促排卵IVF周期成熟卵(直径≥14mm)的卵泡液,分离颗粒细胞,抽提、纯化mRNA.将未成熟卵泡颗粒细胞设为研究组,成熟卵泡颗粒细胞设为对照组,采用含8300个人类基因的基因芯片进行差异性表达研究,并对其中有差异性表达的10个基因采用荧光实时定量技术(Real-time RT-PCR)进行验证. 结论： 1.经包含8300个基因位点的人表达谱基因芯片筛企,窦卵泡发育中期(直径5～12mm)的未成熟卵泡颗粒细胞和成熟卵泡颗粒细胞存在462个差异表达基冈,说叫人类卵母细胞发育、成熟过程受颗粒细胞所分泌的一系列物质时空上的调控密切相关. 2.对基因芯片结果比率不同的10个差异表达基因进行Real-time RT-PCR验证,除1个基因无显著差异外,其余均有显著差异,符合率达90﹪.提示本实验基因芯片的可信度,我们可以根据基因芯片的结果进行基因表达产物及其功能的进一步研究. 3.经基因芯片筛查未成熟卵泡颗粒细胞和成熟卵泡颗粒细胞存在190个基因上调表达,272个基因下调表达.说明随着卵泡的发育、成熟,有更多的调节凶子参与,颗粒细胞在卵泡成熟阶段所具有的功能更复杂. 4.分析未成熟卵泡和成熟卵泡颗粒细胞差异表达基凶,提示不同卵泡发育阶段颗粒细胞所起的作用不同.未成熟卵泡颗粒细胞主要是以促进细胞增殖、雌激素分泌和缝隙连接等基因表达占优势;成熟卵泡颗粒细胞主要与孕激素分泌、信号转导、物质转运、细胞外基质和粘液分泌等细胞功能相关基因表达占优势. 5.基因芯片结果提示不同卵泡发育阶段颗粒细胞产生不尽相同的信号转导因子、生长因子、细胞周期调节因子、旁分泌因子和能量物质作用于卵母细胞,调节卵母细胞成熟,或接受卵母细胞分泌的物质发生功能上的改变. 6.芯片结果提示除了与既往研究相一致的在卵泡发育过程中的基因优势表达和功能外,尚有许多在卵泡发育、成熟过程中功能未明的基因有待进一步研究.对这些基因及其表达产物和功能的研究将有助于增加我们对卵泡/卵母细胞发育、成熟机理的全面了解. 三、人类卵子体外成熟--体外受精-胚胎移植-冷冻复苏 目的：观察取卵周期准备、卵泡直径、IVM培养液成分和培养时间对未成熟卵的获取率、成熟率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、着床率、妊娠率和出生率及其胚胎冷冻复苏移植的影响. 方法： 以2002年7月～2004年7月在本院生殖中心进行卵子体外成熟的不孕不育患者为研究对象.以自然周期+绒毛膜促性腺激素(hCG),或单用尿促卵泡素(HMG)+hCG,或常规促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)长方案促排卵周期由于有卵巢过度刺激倾向而改为卵子体外成熟(IVM)周期获取未成熟卵.取卵时最大卵泡直径10～13.5mm不等,分别以TCM199或人输卵管液(HTF)为基础培养液,分别加入10﹪人血清蛋白(PPF) 或10﹪合成血清物质(SSS),再添加0.075 IU/ml r-FSH+0.5IU/mL hCG+1μg/mlβE2于上述IVM培养液中,观察取卵周期准备、卵泡直径、IVM培养液成分对未成熟卵的获取率、成熟率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、着床率、妊娠率和出生率及其胚胎冷冻复苏移植结局. 结论： 1.IVM周期取卵时卵泡大小不均一且最大卵泡直径≥12mm时,受精率和胚胎质量下降,将影响胚胎着床率和累积妊娠率. 2.以TCM199为基础培养液能提高未成熟卵体外成熟后受精卵所形成胚胎的发育能力和着床率,但仍低于常规IVF周期的着床率. 3.IVM胚胎经冷冻复苏,胚胎移植能获得与常规IVF周期相似的妊娠成功,出生后代健康无畸形.

目录

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缩略词表

前言

第一部分 人未成熟卵和成熟卵卵丘复合物超微结构改变

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

1.4结论

第二部分人类未成熟卵泡和成熟卵泡颗粒细胞基因表达差异

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4结论

第三部分人类卵子体外成熟——体外受精-胚胎移植-冷冻复苏

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

1.4结论

参考文献

综述一卵母细胞、卵泡发育的形态学和卵巢微环境分子生物学研究

综述二人卵母细胞体外成熟研究进展

附录

致谢