NMDA受体亚单位装配、运输以及膜表面表达的分子机制

摘要

NMDA受体属于离子型谷氨酸受体,它在突触传递,突触可塑性及兴奋性毒性中都扮演着重要的角色.与其它非NMDA受体不同,功能性NMDA受体主要是由NR1和NR2亚单位装配而成的异聚体,而单独在异源系统中表达的受体亚单位大都滞留在ER,不能在质膜上表达.其中,NR1亚单位有八种剪接变体,是形成功能性NMDA受体通道的必要成分,NR2亚单位包括NR2A-NR2D四个相关基因,不同的NR1亚单位剪接变体和不同的NR2亚单位决定了受体不同的通道性质.这种亚单位组成的差异形成了NMDA受体的功能异质性,并很大程度上成为NMDA受体多样而复杂的生理功能的内在结构基础.尽管目前的研究已经让人们很好地了解了含不同亚单位的NMDA受体的功能特征,但是这种功能特征的内在结构基础,特别是对于NMDA受体是如何实现亚单位特异性装配,如何通过ER质控等受体早期发生事件的内在机制还不是非常清楚.有研究提示,NR1的C末端有决定ER滞留的RXR基序,只有与NR2亚单位共表达才能掩盖此基序并表达在细胞膜上,但是NR2亚单位当单独在异源系统中表达时也是滞留在ER,不能表达到细胞膜上,它的,ER滞留机制目前并不清楚.另外,来自AMPA和KA受体的研究提示,离子型谷氨酸受体亚单位的装配是二聚体的二聚化这样一个过程,即亚单位先形成同二聚体,然后同二聚体之间再装配成异四聚体,其中,AMPA和KA受体亚单位的ATD决定了同二聚体的形成,S1,跨膜区以及S2区参与了异聚体的装配,截短再连接实验同样提示NMDA受体的装配也是二聚体的二聚化这样一个过程,但是决定NMDA受体亚单位装配的区域并不明确.有研究提示NR1亚单位的ATD对形成功能性受体是必须的,而NR1亚单位的整个N末端参与了受体亚单位的装配,但是也有研究提示缺失了ATD的NR2亚单位可以与NR1亚单位形成功能性受体.因此对于NMDA受体N末端在受体装配中的作用也不是非常清楚. 为了更好地探索这些科学问题,我们首先将一种生物物理的方法---荧光共振能量转移(nuorescence resonance energy transfe,FRET),应用到NMDA受体装配的研究中.因为FRET技术可以实时观察活细胞内的蛋白之间的相互作用并且被广泛应用于多种受体装配,构象改变等研究中.我们的结果显示,当NRla,NR2A.NR2B亚单位单独在HEK293细胞中表达时,可以各自形成同二聚体,当与其它亚单位共表达形成NMDA受体时,这些同聚体仍然存在.这一结果也进一步支持NMDA受体的装配是一个二聚体的二聚化过程.同时,通过推算FRmax,我们发现NR亚单位同二聚体的N端构象在形成功能性受体的前后是发生变化的,特别是对于.NRla亚单位,其同二聚体的N端构象会因与其配对的NR2亚单位的不同而发生不同的改变.而利用不同N端结构域缺失的手段我们发现,在HEK293细胞内,即便整个N末端(N terminus, NT),即N端大约前550个氨基酸都缺失,NR亚单位在ER内也能形成同聚体或彼此之间形成异聚体.这就提示NT对于NMDA受体亚单位之间的装配不是必要条件.结合活细胞表面染色和电生理的方法,我们还发现,截掉NR亚单位的氨基酸末端区域(amino-terminal domain,ATD),即截掉N端大约前400个氨基酸的NR2A,NR2B亚单位仍然可以与野生型的NRla亚单位形成表面表达的功能性受体.但是对于截掉ATD的NRla亚单位来说,它只能与全长的NR2B亚单位形成功能性受体,但是不能与全长的NR2A亚单位形成功能性受体.如果将NR2A与NR2B的.ATD交换,结果则完全相反,当NR2A的.ATD被换成NR2B的ATD时(NR2A-ATD-NR2B),此嵌合体可以与缺失了ATD的NR1a亚单位在细胞膜上表达,但是当NR2B的.ATD被换成NR2A的ATD时(NR2B-ATD-NR2A),此嵌合体却不能与缺失了ATD的NRla亚单位共同表达在细胞膜上,而是都滞留在ER,从而提示NR2A的ATD可能有ER滞留的作用,只有在NRla的ATD帮助下,NR2A的ATD这种ER滞留作用才能被掩盖.

目录

摘要

缩略语

引言

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

综述一 生物学研究中的单分子检测

综述二 RNA干扰技术在哺乳动物中的应用

在读期间发表的论文、参加的学术会议

致谢