赤霉病污染大麦作物中结合态脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测体系构建研究

摘要

赤霉病是大麦小麦以及其他小作物中常见的一种真菌病害，其流行不仅导致作物减产，更会产生真菌毒素威胁人和动物的安全．近年来研究表明，在大麦和小麦中存在着结合态真菌毒素，由于这种形式的毒素，尤其是结合脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)不能被常规溶剂提取并检测其含量，一旦在人和动物体内消化释放出这种毒素，将成为潜在的食品安全威胁．
　　 本研究比较了三种不同粉碎颗粒度对大麦中DON测定的影响，其中细颗粒的测定结果高于粗颗粒，不过并不是所有样品都能够做出均匀响应；在三种不同提取条件的比较中，5g/40mL的比率，较之其他两种能够减少取样误差，因而取得较理想的提取效果．同时比较了三种DON的测定方法：GC—ECD，GC/MS和EZ—TOX试剂盒，试验结果发现GC的优点是结果比较稳定，但日常维护费用较高，对标准校正物的依赖性较强，样品处理以及测定时间也较长；EZ—TOX测定结果迅速，在测定范围内较结果理想，但是测定范围有限，而且每5个样品的测定至少需要3个标准物绘制标准曲线，因而难免会影响结果的稳定性。通过比较木瓜蛋白酶，α—淀粉酶/戊基葡糖苷酶，纤维素酶/木质素酶处理之后对大麦样品中DON测定的影响，在大麦样品中存在结合态DON，而其中木瓜蛋白酶的处理效果较好，DON的值增加了16—28％．
　　 采用三氯乙酸(TCA)溶剂水解污染大麦样品，发现样品中结合态DON普遍存在．但是限于高温条件下，TCA水解的样品测定图谱噪音较大，干扰因素较多，直接影响到测定结果，因而选用具有相似的水解效果(试验过程中不需要加碱中和反应)，测定图谱更优的’TFA水解处理样品。采用Doehlert Matrix实验设计，对TFA溶剂水解测定大麦中总DON的试验条件进行了优化，通过PC SAS以及专业的Design—Expert软件分析，从不同角度对构建的模型进行了验证和确认，证明该试验模型很理想，因变量总DON测定值在模型中得到了最大响应，即在优化条件为：反应时间54min，温度133℃，TFA浓度1.25M。经过反复重复实验验证，确认该方法对于测定不同大麦麦芽样品的可行性．同时还测定了优化条件下DON的回收率为90—98％，说明了该定量方法的准确性．在该优化实验条件下比较了8种不同净化柱对测定大麦中DON的影响，计算不同净化柱对DON的回收率，并比较了每两种柱子测定样品的图谱与标准工作曲线的叠加图，在综合评价上述两个指标之后，发现在该实验条件下，Alumina：C18和Mycosep227是8种柱子中净化效果最好的．
　　 同时在TFA优化实验条件下还筛查了污染大麦中的结合态DON的情况，其中40％的大麦中存在此结合化合物；在制麦芽的浸泡阶段，有大量的结合态DON流失，而其他过程则变化不明显，表明结合态DON可溶于水．也进一步证明这种测定方法的有效性和可观的应用前景。

目录

文摘

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论文说明：图表目录、缩略词表

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致谢

第一章文献综述

1.大麦与小麦中赤霉病(Fusarium Head Blight)

1.1赤霉病的致病真菌及感染症状

1.2赤霉病的发生和流行

1.3大麦赤霉病对大麦制麦芽喝啤酒酿造的影响

1.4赤霉病造成的经济损失

2.赤霉病侵染大麦中的真菌毒素

2.1单端孢霉烯族化合物

2.2脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素，DON)

3.结合态脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Conjugated Deoxynivalenol)

3.1结合态真菌毒素(Conjugated Mycotoxins)

3.2结合态DON与FHB抗性的关系

3.3结合态脱氧雪腐镰刀菌烯醇的重要性

4.课题背景及研究意义

第二章.不同前处理条件对大麦DON测定的影响

1.材料与方法

1.1材料

1.2主要试剂

1.3仪器设备

1.4实验方法

2.数理统计分析

3.结果与讨论

3.1不同粉碎度的颗粒大小分布

3.2不同粉碎度对DON测定的影响

3.3储存时间对DON测定的影响

3.4不同提取条件对大麦中DON测定的影响

4.结论

第三章三种DON测定方法(GC-ECD、GC/MS和EZ-TOX)的比较

1.材料与方法

1.1材料

1.2主要试剂

1.3仪器设备

1.4实验方法

2.统计分析

3.结果与讨论

4.结论

第四章酶水解处理对大麦中总DON测定的影响

1.材料与方法

1.1材料

1.2主要试剂

1.3仪器设备

1.4实验方法

2.数理统计分析

3.结果与讨论

3.1不同酶处理对大麦中DON测定的影响

3.2三种酶处理对大麦样品中真菌毒素测定的影响

4.结论

第五章TCA水解前处理测定大麦中结合态DON

1.材料与方法

1.1材料

1.2主要试剂

1.3仪器设备

1.4实验方法

2.结果与讨论

2.1 TCA水解大麦提取液和残渣

2.2 TCA水解大麦样品条件的选择

2.3 TCA水解实验条件的优化

2.4 TCA水解处理样品与TFA水解处理样品的图谱比较

3.结论

附图

第六章 TFA水解处理测定大麦中结合态DON及其实验条件优化

1.材料与方法

1.1材料

1.2主要试剂

1.3仪器设备

1.4实验方法

2.实验设计

3.结果与讨论

3.1第一次Doehlert设计实验

3.2第二次Doehlert设计实验

4.结论

第七章大麦中总DON测定优化试验的重复验证与回收率测定

1.材料与方法

1.1材料

1.2主要试剂

1.3仪器设备

1.4实验方法

2.数理统计分析

3.结果与讨论

3.1优化实验的重复验证

3.2真菌毒素测定标准工作曲线的绘制：

3.3 B型单端孢霉烯族化合物的回收率测定

4.结论

第八章不同净化柱处理对TFA酸水解条件下DON测定的影响

1.材料与方法

1.1材料

1.2净化柱

1.3主要试剂

1.4仪器设备

1.5实验方法

2.结果与讨论

2.1比较不同柱子净化样品对DON测定的回收率的影响

2.2不同柱子净化样品的图谱比较

3.结论

第九章优化实验条件下储存大麦和麦芽样品中结合态DON的测定

1.材料与方法

1.1材料

1.2主要试剂

1.3仪器设备

1.4实验方法

2.数理统计分析

3.结果与讨论

3.1大麦中结合态DON的检测

3.2麦芽中结合态DON的检测

4.结论

第十章结论和后续研究展望

1.结论

2.后续研究展望

参考文献

作者简历及博士期间发表的文章