新型生物农药米多霉素类化合物的生物合成和活性评价

摘要

米多霉素(mildiomycin，MIL)是从放线菌Streptoverticillium rimofaciens的培养液中分离到的一种核苷类次级代谢产物，对多种植物的白粉病具有显著防治作用。本文研究目的在于通过在培养过程中添加米多霉素的理论前体：羟甲基胞嘧啶的结构类似物，利用微生物自身的合成代谢体系合成多种米多霉素的结构类似物，以获得活性更高的生物农药。对其中两种衍生物：米多霉素胞嘧啶衍生物(MIL-C)和米多霉素5-氟胞嘧啶衍生物(MIL-F)，开展了发酵条件和分离工艺优化，并进行了分子结构鉴定、生物活性和毒性评价。
　　 1.在Streptoverticillium rimofaciens的培养过程中添加5-氟胞嘧啶后，获得了米多霉素5-氟胞嘧啶衍生物(MIL-F)。通过对发酵条件优化，使MIL-F产量提高到了0.6g/l。对从发酵液分离提取MIL-F工艺进行了研究，获得了纯度超过95％的MIL-F产品。采用红外光谱、核磁共振及质谱分析等方法证明了所获得的MIL—F产物的分子结构确实是氟原子取代了MIL中胞嘧啶环上的羟甲基。考察了MIL-F的生物活性及毒理学性质，确定了MIL-F是一种高效、低毒、无刺激的生物农药。
　　 2.在Streptoverticillium rimofaciens的培养基中添加胞嘧啶后，获得了米多霉素胞嘧啶衍生物(MIL-C)。考察了MIL-C发酵条件，发现适当控制胞嘧啶加入量可以抑制米多霉素合成，使MIL-C成为唯一产物；通过单因素实验、Plackett-Burman实验和响应面中心组合实验使MIL-C的产量达到1336.5 mg/l，比优化前产量提高了3.6倍。在详细研究了MIL-C在DK110弱酸性阳离子交换树脂上的离子交换特性的基础上，通过优化离子交换条件分离得到了纯度约70％的MIL-C粗产品。经树脂吸附脱色和CM650离子交换凝胶柱精制，使MIL-C纯度达到了95％以上。采用全波段扫描、核磁共振及质谱分析等方法证明了所获得的MIL-F产物的分子结构确实是氢原子取代了MIL中胞嘧啶环上的羟甲基。
　　 3.考察了MIL-C的体内、体外生物活性，并开展了一年两地的田间小区实验。实验结果表明MIL-C制剂对南瓜白粉病和黄瓜白粉病都具有显著防效，药力控制良好。MIL-C对南瓜和黄瓜安全，对花和果实生长均无不利影响，对周围环境友好。对MIL-C进行安全性评价确定MIL-C是一种低毒、无刺激的农用抗生素。
　　 4.结合chemoffce组件对MIL、MIL-C和MIL-F参数进行分析比较，可以初步推断MIL的主要药效基团是可能是精氨酸上的胍基，该结构如果被破坏会导致MIL失活。通过本论文的研究，获得了两种米多霉素的结构类似物：MIL-F和MIL-C；经发酵工艺优化，大幅度提高了它们的产量；对生物活性的测试结果表明，它们对白粉病的防治效果都高于米多霉素，有可能成为高效、低毒的新型农药。对米多霉素及其类似物结构-功能关系的研究为将来发现新农药打下了良好的基础。

目录

文摘

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致谢

第一章文献综述

1.1白粉病和米多霉素

1.1.1国内白粉病流行现状

1.1.2国内外白粉病的防治

1.2米多霉素国内外研究进展

1.2.1米多霉素的分子结构

1.2.2米多霉素的理化性质

1.2.3米多霉素的分析方法

1.2.4米多霉素的生物活性以及安全性评价

1.2.5米多霉素产生菌的菌种选育

1.2.6米多霉素的发酵技术

1.2.7 MIL在体内可能的合成机理以及对真菌的可能作用机制

1.2.8米多霉素的分离提取过程

1.3先导化合物和米多霉素类衍生物研究进展

1.3.1先导化合物的研究进展

1.3.2米多霉素类衍生物研究进展

1.4计算机辅助设计

1.4.1计算机辅助药物设计的一般方法

1.4.2计算机辅助药物设计常用计算程序和常用软件

1.4.3计算机模拟研究应用实例

1.5本论文的研究目的及主要研究内容

第二章材料与方法

2.1实验材料与仪器

2.1.1实验材料

2.1.2实验设备

2.2实验方法

2.2.1米多霉素衍生物的生物合成

2.2.2米多霉素衍生物的分析方法

2.3.3生物测定法

第三章米多霉素5-氟胞嘧啶衍生物生物合成及分离纯化

3.1引言

3.2实验方法

3.2.1 MIL-F发酵液的预处理

3.2.2 MIL-F分离提取

3.3结果与讨论

3.3.1前体添加时间对MIL-F表达量的影响

3.3.2不同装液量对MIL-F生物合成的影响

3.3.3含氮化合物对MIL-F生物合成的影响

3.3.4前体添加浓度对MIL-F生物合成的影响

3.3.5培养时间对MIL-F生物合成的影响

3.3.6 MIL-F分离纯化工艺

3.3.7 MIL-F发酵液的发酵分离耦合

3.4本章小结

第四章米多霉素5-氟胞嘧啶衍生物的结构验证及活性、安全性评价

4.1引言

4.2 MIL-F结构预测

4.2.1 MIL-F理化性质

4.2.2米多霉素结构的仪器分析

4.3 MIL-F活性测定

4.3.1 MIL-F体外活性测定

4.3.2 MIL-F体内活性测定

4.4 MIL-F毒理学性质研究

4.4.1材料与方法

4.4.2实验结果与结论

4.5本章小结

第五章米多霉素胞嘧啶衍生物生物合成及培养条件优化

5.1引言

5.2实验方法

5.2.1米多霉素胞嘧啶衍生物的生物合成

5.2.2 MIL-C培养条件优化

5.3结果与讨论

5.3.1单因素优化实验

5.3.2 Plackett-Burman实验

5.3.3响应面设计

5.3.4优化后培养基发酵能力的验证

5.4本章小结

第六章MIL-C分离纯化条件的优化

6.1引言

6.2发酵液的预处理

6.3 MIL-C在离子交换树脂上的离子交换过程

6.3.1离子交换树脂的静态筛选

6.3.2 MIL-C在离子交换树脂上的离子交换动力学

6.3.3 pH值对DK110树脂吸附容量的影响

6.3.4 HIL-C在离子交换树脂柱上的穿透曲线

6.3.5离子交换吸附等温线

6.4含胞嘧啶和MIL-C发酵液在DK110树脂上的固定床离子交换模型

6.4.1动力学模型理论

6.4.2模型参数的确定

6.4.3模型预测

6.5 MIL-C在离子交换树脂上的洗脱过程

6.5.1 MIL-C在树脂上的洗脱曲线

6.5.2洗脱剂的筛选

6.5.3洗脱流速对洗脱过程的影响

6.5.4洗脱剂浓度对洗脱过程的影响

6.6 MIL-C发酵液的脱色过程

6.6.1 MIL-C发酵液中色素标准曲线

6.6.2脱色树脂的筛选

6.6.3 pH值对脱色效果的影响

6.7 MIL-C粗产品的精制过程

6.7.1 C18填料柱层析

6.7.2 CM650离子交换层析

6.8本章小结

第七章MIL-C的结构验证、生物活性和毒理学评价

7.1引言

7.2 MIL-C的结构验证

7.2.1 MIL-C理化性质

7.2.2 MIL-C的HPLC分析

7.2.3 MIL-C薄层层析测定

7.2.4全波段扫描

7.2.5 1H-NMR图谱

7.2.6 ESI图谱

7.3 MIL-C的活性分析

7.3.1 MIL-C体外活性评价

7.3.2 MIL-C盆栽实验

7.3.3 MIL-C田间小区实验

7.4 MIL-C的毒理学研究

7.5本章小结

第八章米多霉素类化合物的CADD模拟研究

8.1引言

8.2方法

8.2.1.1米多霉素类化合物的低能构象和能场分布

8.2.2米多霉素类化合物的结构模拟

8.2.3米多霉素类化合物的抗菌基团预测

8.3结果与讨论

8.3.1米多霉素类化合物的低能构象和相关参数分析

8.3.2米多霉素类化合物的结构模拟

8.4米多霉素类化合物抗菌活性药效团预测

8.5本章小结

第九章结论与展望

9.1实验结论

9.2展望

参考文献

博士期间已发表录用的文章

附图