棕尾别麻蝇贮存蛋白基因克隆及寄生对其表达的影响

摘要

本文成功克隆了编码棕尾别麻蝇Boettcherisca peregrina芳基贮存蛋白及LSP-2贮存蛋白亚基的cDNA序列，对其表达模式做了分析，并研究了丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis寄生对其组成和含量的影响，结果如下： 1棕尾别麻蝇贮存蛋白亚基基因的克隆与序列分析序列分析结果表明，所克隆的编码棕尾别麻蝇Arylplhorin 蛋白亚基的cDNA全序列总长为2,534bp，开放阅读框长2,346bp。预测该蛋白质亚基分子量约为95.42kDa，等电点约为5.01。SignalP在线分析结果表明，该蛋白质含有一段长15aa的信号肽。分析该蛋白质亚基的氨基酸残基组成，发现其芳香族氨基酸含量约占23.81％。所获得的编码LSP-2蛋白亚基的全长cDNA序列长度为2，235bp，其开放阅读框长度为2，106bp。预测该蛋白质亚基的分子量约为82.96kDa，等电点约为5.94。该蛋白质亚基亦含有一段长度为19aa的信号肽序列。分析该蛋白质亚基的氨基酸残基组成，发现其芳香族氨基酸含量约占11.13％(小于15％)，不同于Arylphorin蛋白亚基。 ClustalW分析及系统进化树构建结果表明，棕尾别麻蝇的 Arylphorin及LSP-2亚基分别与红头丽蝇Calliphoria vicina的两种贮存蛋白最为相似，并在系统进化树中与其聚为一类。在不同昆虫的贮存蛋白亚基之间存在较高的相似性，说明贮存蛋白具一定保守性，分类学亲缘关系越近的昆虫其贮存蛋白保守性越高。 2棕尾别麻蝇脂肪体贮存蛋白基因表达的日龄变化及寄生对其影响通过预备实验，确定了用于棕尾别麻蝇脂肪体贮存蛋白基因表达半定量RT-PCR分析的反应体系及条件，并确定反应起始模板的用量。半定量RT-PCR结果表明，编码Arylphorin亚基和LSP-2亚基基因的转录表达水平与随日龄变化密切相关。其中，编码Arylplaorin亚基基因的表达趋势为，于1龄幼虫开始转录表达，表达量逐渐上升，在3龄幼虫时达到最高值，尔后于预蛹期显著下调，初孵幼虫、蛹期及成虫期均无转录表达；编码LSP-2亚基基因的表达趋势基本与编码Arylphorin亚基基因的表达趋势相同，只是其在1龄幼虫期亦无转录表达，其转录表达滞后于Arylphorin亚基基因。另外，半定量结果还显示，非寄生蛹与寄生蛹中的脂肪体均不转录表达贮存蛋白基因，表明寄生对于寄主脂肪体转录表达贮存蛋白基因并无影响。 3.丽蝇蛹集金小蜂寄生对寄主蛹可溶性蛋白与芳基贮存蛋白组成和含量的影响本文研究了棕尾别麻蝇蛹被丽蝇蛹集金小蜂寄生后其脂肪体和血淋巴中可溶性蛋白及芳基贮存蛋白组成与含量的变化。寄生蛹脂肪体可溶性蛋白及芳基贮存蛋白的组成与未寄生蛹相比没有明显变化，但含量均低于未寄生蛹。寄生蛹血淋巴中可溶性蛋白的组成与未寄生蛹相比差异不大，其含量低于未寄生蛹。与脂肪体不同，寄生后12h时寄生蛹血淋巴中芳基贮存蛋白亚基的免疫印迹结果出现2条免疫条带，这表明其可能先于未寄生蛹发生降解，而芳基贮存蛋白的含量与未寄生蛹相比差异多不显著。

目录

文摘

英文文摘

前言

声明

致谢

第一章 昆虫贮存蛋白及不同理化因子对其影响

1昆虫贮存蛋白概述

1.1昆虫贮存蛋白

1.2昆虫贮存蛋白分类

1.3昆虫贮存蛋白的功能

2不同因子对昆虫贮存蛋白影响

2.1不同理化因子(温度、辐射及药物处理)对贮存蛋白的影响

2.2寄生对昆虫贮存蛋白的影响

3小结

第二章棕尾别麻蝇贮存蛋白亚基因的克隆与序列分析

1材料与方法

1.1供试材料

1.2研究方法

2结果

2.1总RNA质量检测

2.2编码Arylphorin亚基的cDNA全序列扩增与序列分析

2.3编码LSP-2亚基的cDNA全序列扩增与序列分析

2.4多序列比对

3讨论

第三章棕尾别麻蝇脂肪体贮存蛋白基因表达的日龄变化及寄生对其影响

1材料与方法

1.1供试虫源

1.2研究方法

2结果与分析

2.1半定量RT-PCR体系及反应条件的确立

2.2脂肪体贮存蛋白基因转录表达的随日龄变化及寄生对其影响

3讨论

第四章丽蝇蛹集金小蜂寄生主蛹可溶性蛋白与芳基贮存蛋白组成与含量影响

1材料与方法

1.1供试虫源

1.2接蜂方法

1.3样品制备

1.4可溶性蛋白含量的测定

1.5可溶性蛋白的SDS-PAGE分析

1.6芳基贮存蛋白的Western印迹分析

1.7芳基贮丰蛋白求恩间接ELISA检测

1.8数据分析

2结果

2.1丽蝇蛹集金小蜂寄生对寄主脂肪体可溶性蛋白组成与含量的影响

2.2丽蝇蛹集金小蜂寄生对寄主脂肪体芳基贮存蛋白含量的影响

2.3丽蝇蛹集金小蜂寄生对寄主血淋巴可溶性蛋白组成与含量的影响

2.4丽蝇蛹集金小蜂寄生对寄主血淋巴芳基贮存蛋白含量的影响

3讨论

第五章总讨论

1贮存蛋白研究概况

2棕尾别麻蝇贮存蛋白基因克隆

3寄生对贮存蛋白基因转录及其含量的影响

4本研究的特色与创新点

5今后研究的方向

参考文献

作者简历