绿木霉(TRICHODERMA VIRENS)TY009菌株胶霉毒素分离纯化及绿色荧光蛋白标记研究

摘要

本实验室在前期工作中发现绿木霉(Trichodermavirens)TY009菌株的次生代谢物中有一个组分具有抑制水稻纹枯病菌菌丝生长的生物活性。 本文对T.virens菌株TY009代谢物的活性组分进行分离、纯化和鉴定，明确了该活性物质对立枯丝核菌的菌丝生长及对菌核萌发的抑制作用；同时构建了一个可以在木霉中表达绿色荧光蛋白GFP基因的质粒载体，通过遗传转化，对T.virens菌株TY009进行绿色荧光蛋白标记，并利用标记菌株观察了绿木霉对水稻纹枯菌菌核的定殖。试图评价绿木霉(Trichodermavirens)TY009菌株防治水稻纹枯病的潜力。 主要研究结果： 1、绿木霉TY009菌株胶毒紊的分离、纯化和鉴定及其对水稻纹枯病菌的抑制作用通过乙酸乙酯萃取，色谱柱分离、薄层层析分离得到纯化的活性组分，经质谱分析，木霉代谢物中的一个活性组分的结构初步鉴定为胶霉毒素，其分子量为326道尔顿。提纯的胶霉毒素在100℃条件下，加热60min仍对纹枯菌病菌的生长有抑制作用。胶霉毒素对水稻纹枯病菌的抑制作用在酸性条件下得到增强，在碱性条件下减弱。 胶霉毒素对水稻纹枯病菌有显著的抑制作用，当其浓度为80μg/ml时完全抑制了其菌丝生长；胶霉毒素在浓度160μg/ml时菌核的萌发率为0.00％，40μg/ml时菌核的萌发率为71.67％，对照萌发率为100％。 2、绿木霉TY009菌株绿色荧光蛋白标记构建了带有绿色荧光蛋白基因gfp片段的适于真菌的表达载体pSilent-EGFP，通过PEG-CaCl2介导的原生质体法导入绿木霉TY009菌株，得到稳定的转化子。转化效率是3～4转化子/μgDNA。PCR及荧光检测可知，构建的载体已将绿色荧光蛋白基因导入木霉的基因组，并且得到表达。 gfp转化子菌株的不同生长阶段荧光表达有差异，与木霉在不同阶段细胞活力有关：幼嫩菌丝的细胞活力强，荧光表达强烈，而老熟菌丝细胞活力差，荧光表达弱，在老熟菌丝中，细胞质浓缩部位有荧光反应，而无细胞质的中空部位没有荧光反应。厚垣孢子在还未成熟时(尚与菌丝连接)荧光表达强，成熟后的厚垣孢子荧光表达相对减弱。 gfp转化子生物学特性测定显示，在产孢量上与野生型菌株没有差异，在生长速度上转化子菌株比野生型菌株TY009慢并且差异显著，转化子之间有的也存在显著差异。对绿色荧光蛋白标记的木霉菌株检测分析后发现，gfp转化子的生防特性与野生型菌株相比没有差异。3个强荧光表达突变子产生的代谢物的粗提物的成分在种类上与绿木霉菌株TY009所产生的代谢物的粗提物的成分是相同的。 3、绿色荧光蛋白标记绿木霉菌株对水稻纹枯病菌菌核的定殖利用强荧光表达转化子观察木霉对纹枯病菌菌核的定殖，在菌核和木霉接触2d后，菌核表面形成了木霉菌丝包被；Sd后木霉菌丝进入菌核的浅表部位；20d进入菌核的部位加深；40d后整个菌核包括菌核的中心部位都有荧光出现，菌丝穿透拟薄壁组织，菌核变软。在菌核内部存在大量厚垣孢子，厚垣孢子萌发产生菌丝，菌丝主要沿着菌核拟薄壁组织细胞壁扩展。 上述研究结果为阐明绿木霉(Trichodermavirens)TY009菌株的生防机制及其进一步开发利用奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

致谢

第一章文献综述

1木霉次生代谢物质及其抗菌活性

1.1木霉次生代谢物质的多样性及其抗菌活性

1.2木霉次生代谢物的作用方式

1.3木霉次生代谢物质的分离和纯化

1.4胶霉毒素及其抗菌活性和分离纯化

2木霉的绿色荧光蛋白标记及其应用

2.1木霉的定殖及其研究方法

2.2木霉绿色荧光蛋白标记的意义及研究进展

2.3绿色荧光蛋白标记木霉的方法

2.4绿色荧光蛋白标记在木霉生防机制研究中的应用

3我国木霉胶霉毒素及其绿色荧光蛋白标记的研究现状

4本研究的目的和意义

第二章绿木霉TY009菌株胶霉毒素的分离纯化及其对水稻纹枯病菌的抑制作用

引 言

1材料与方法

1.1试验材料

1.2试验方法

2结果与分析

2.1玻璃纸培养法检测绿木霉TY009代谢物对水稻纹枯病菌菌丝生长和菌核形成的作用

2.2绿木霉TY009代谢物的提取及分离结果

2.3绿木霉TY009代谢物活性组分对水稻纹枯病菌菌丝生长和菌核形成的作用

2.4绿木霉TY009代谢物活性组分对水稻纹枯病菌菌核萌发率的影响

2.5绿木霉TY009代谢物活性组分的结构鉴定及其对温度、pH变化的敏感性

3讨论

3.1绿木霉TY009次生代谢物胶霉毒素的分离及纯化

3.2胶霉毒素活性检测中有机溶剂的选择

3.3绿木霉TY009胶霉毒素对水稻纹枯病菌的抑制作用

3.4胶霉毒素对温度变化的敏感性

第三章绿色荧光蛋白真菌表达载体构建及其在绿木霉TY009中的转化

引言

1 材料与方法

1.1试验材料

1.2试验方法

2结果与分析

2.1 pSilent-EGFP载体的构建

2.2绿木霉TY009绿色荧光蛋白标记转化子验证

2.3绿木霉TY009绿色荧光蛋白标记转化子生物学特性测定

3 讨论

第四章绿木霉TY009绿色荧光蛋白标记转化子的检测分析

引 言

1 材料与方法

1.1试验材料

1.2试验方法

2结果与分析

2.1绿木霉TY009绿色荧光蛋白标记转化子与水稻纹枯病菌对峙培养试验结果

2.2玻璃纸培养法检测绿木霉TY009绿色荧光蛋白标记转化子代谢物对水稻纹枯病菌菌丝生长的作用

2.3玻璃纸培养法检测绿木霉TY009绿色荧光蛋白标记转化子代谢物对水稻纹枯病菌菌核形成的抑制作用

2.4绿木霉TY009绿色荧光蛋白标记转化子的代谢物质的分析

2.5绿木霉TY009绿色荧光蛋白标记转化子对水稻纹枯病菌菌核的定殖

3 讨论

3.1绿木霉TY009绿色荧光蛋白标记转化子的生防特性

3.2绿木霉TY009绿色荧光蛋白标记转化子对水稻纹枯菌菌核的定殖

第五章全文总结

1绿木霉TN009菌株胶霉毒素的分离纯化及其对水稻纹枯病菌的抑制作用

2绿木霉TY009菌株绿色荧光蛋白标记

3绿木霉TY009绿色荧光蛋白标记转化子对水稻纹枯病菌菌核的侵染和定殖

4后续工作

参考文献

附录