DMOG改善骨髓间充质干细胞生存能力以及相关机制的探讨

摘要

实验背景： 随着经济社会的发展和人民生活水平的提高，心脑血管疾病已经成为人类健康的头号杀手。心肌梗死的发生率、致残率和致死率明显上升，尽管近年来药物治疗和介入治疗得到了快速发展，缺血性心肌病患者的预后有了明显的改善，但药物治疗和介入治疗终归不能修复坏死的心肌。骨髓间充质干细胞(MSCs)具有自我更新能力和横向分化能力，移植到心梗局部后能够分化为内皮细胞、血管平滑肌细胞和心肌细胞样细胞，促进新生血管的形成。大量的基础研究和临床前期研究发现MSCs能够挽救濒死的心肌，减少心梗面积进而改善心肌梗死后的心功能，因此骨髓间充质干细胞在心血管疾病中的应用是近年来研究的热点，成为攻克心血管疾病难题的一种非常有前景的治疗手段。但是，MSCs改善心功能的能力有限，大量的证据表明MSC移植对心功能的改善是轻中度的，大部分研究结果显示MSCs移植对心功能的改善只有5-6％左右，甚至有些临床试验没有观察到心功能的改善，这远远达不到我们的预期，其中一个很重要的原因是绝大多数的细胞移植到体内后在很短的时间内发生死亡，研究报道90％的MSCs在移植后的1天内死亡。因此，找到一种能够提高MSCs生存能力的方法显得尤为迫切。 DMOG是一种脯氨酰羟化酶抑制剂，能够抑制细胞内HIF-1α的降解，继而使细胞核内很多基因(如EPO、VEGF、Ang1和Glut-1等)的转录和表达增高，继而发挥其保护性作用。在缺血再灌注心肌损伤和急性心肌梗死的动物模型中发现，DMOG能够发挥降低大鼠的心肌重构和抑制炎症反应等保护作用。在体外的研究中发现，DMOG能够改善肿瘤细胞和神经元在缺血清或缺神经营养因子等恶劣环境下的生存能力。但是，DMOG到底能否改善MSCs的生存能力目前没有报道。 实验目的： 研究DMOG是否能增强骨髓间充质干细胞(MSCs)的生存能力，并对可能的作用机制进行探讨。 实验方法： 建立经典的缺血清的凋亡模型，分为正常对照组(Control)、缺血清组(SD)和缺血清DMOG干预组(SD+DMOG)三大组，其中SD+DMOG组又分为100μM、500μM和1000μM三个小组。应用western-blot技术检测DMOG能否降低HIF-1α的在细胞内的降解以及上调其下游Glut-1的表达情况；应用台盼蓝方法来评估DMOG对正常有血清条件培养下的MSCs的毒性作用；通过相差显微镜观察不同组中MSCs形态学上的改变，经缺血清处理后的凋亡细胞体积缩小；应用Hoechst染MSCs的细胞核，通过荧光显徼镜观察不同组中MSCs细胞核的改变，凋亡细胞染色质浓聚、细胞核缩小甚至断裂，荧光显微镜下表现为核小雨亮和不完整；应用免疫组化对cleavedcaspase-3进行染色，阳性细胞定义为凋亡细胞，并使用Hoechst进行染核计算细胞总数，阳性细胞除以总细胞数即为凋亡率；western-blot检测cleavedcaspase-3的表达情况，以进一步验证免疫组化染色的准确性，并进一步探讨DMOG对MSCs凋亡保护的时程进行分析，分6h、12h和24h三个时间点；应用台盼蓝方法对MSCs进行染色来检测细胞死亡情况，阳性细胞即为死亡细胞，阳性细胞除以总细胞数即为死亡率。通过比较不同组之间凋亡和死亡指标的变化，说明DMOG对缺血清条件下MSCs的保护作用。对于除HIF-1α通路外其他的可能作用机制，我们检测了经典的影响细胞凋亡的线粒体通路和与细胞生存密切相关的PI3K/Akt通路。应用western-blot技术检测细胞色素C蛋白在线粒体、胞浆中的表达情况，分析在缺血清状况下细胞色素C从线粒体释放到胞浆中(细胞色素C将进一步与Apaf-1和pro-caspase9形成凋亡复合体激活凋亡通路)的情况，探讨线粒体途径中caspase-3依赖性的凋亡通路在DMOG抗凋亡中的作用；应用western-blot技术检测凋亡诱导因子(AIF)在胞浆和核蛋白中的表达情况，分析在缺血清状况下AIF从胞浆转录到细胞核(AIF转录到细胞核后也能够启动细胞凋亡程序)的情况，探讨线粒体途径中非caspase-3依赖性的凋亡通路在DMOG抗凋亡中的作用，应用western-blot技术检测Akt和磷酸化Akt、ERK和磷酸化ERK的表达情况，明确DMOG能否激活PI3K/Akt和/或MEK/ERK通路，然后应用PI3K特异性阻断剂wortmannin阻断PI3K/Akt通路后，观察DMOG的保护作用(重新检测cleavedcaspase-3染色和台盼蓝分别评估细胞凋亡和死亡)是否消失，从反面来证明DMOG的保护作用是否通过该通路。 实验结果： DMOG在作用浓度范围内，对MSCs没有明显的毒性作用，却能够剂量依赖性地降低MSCs内HIF-1α的降解，上调其下游Glut-1的表达。DMOG能够呈剂量依赖性地改善缺血清后MSCs的形态学上的细胞缩小情况，使Hoechst阳性的细胞核数量明显降低，cleavedcaspase-3的表达降低。Western-blot结果进一步确认了免疫染色cleavedcaspase-3的结果，并提示从缺血清6h开始，DMOG就有降低凋亡的趋势，到12h和24h时达到了统计学差异.类似地，根据台盼蓝染色结果DMOG能够呈剂量依赖性地降低MSCs经缺血清处理后的细胞死亡，从12h开始到72h均能不同程度地降低细胞死亡，具有显著的统计学意义，以上说明DMOG能够降低缺血清所引起的MSCs凋亡和死亡，并呈剂量依赖性和有一定的作用时程。缺血清能够使细胞色素C从线粒体释放到胞浆的数量增加，而DMOG却能降低这种过程；类似地，DMOG能够降低缺血清所引起的AIF的从胞浆向细胞核的转位，说明DMOG能够降低caspase依赖的和非依赖的凋亡通路而发挥保护作用。缺血清能够明显降低MSCs的Akt和ERK的磷酸化水平，DMOG能够逆转Akt的磷酸化表达水平而不能逆转ERK的活化，提示PI3K/Akt通路而不是MEK/ERK通路可能在DMOG的保护中发挥一定的作用.应用PI3K/Akt通路的特异性阻断剂wortamannin后，发现DMOG逆转的Akt磷酸化水平作用消失，相应地，DMOG对MSCs凋亡和死亡的保护作用(分别由cleavedcapase-3和台盼蓝染色检测)也消失了，这从反面也证实了PI3K/Akt通路在DMOG保护中的作用。 实验结论： 1、DMOG能够降低MSCs内HIF-1α的降解和上调下游Glut-1的表达，在作用浓度下对MSCs没有明显的毒性作用； 2、DMOG能够降低缺血清状况下MSCs的凋亡和死亡； 3、caspase-3依赖的和非依赖的线粒体通路可能在DMOG对MSCs保护中发挥了一定的作用； 4、PI3K/Akt通路在DMOG对MSCs的保护中发挥了重要的作用。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

致谢

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述一 骨髓间充质干细胞移植面临的挑战和出路——提高生存能力的新进展

综述二 骨髓间充质干细胞的免疫学特征和免疫调节

附录 博士在读期间发表论文

简历