茶园土壤中氨氧化古菌的丰富度和多样性的研究

摘要

在大多数生态环境中，氨氧化是硝化作用的关键步骤，也是硝化速率的限制因素，是全球氮循环的中心环节。氨氧化古菌在多数水生及陆地生态环境中是微生物群落结构的重要组成部分。但茶园土壤中氨氧化古菌的研究较少。本试验以不同利用年限的茶园土壤为试验材料，通过对茶园土壤中氨氧化古菌的定量研究以及氨单加氧酶amoA基因的序列分析，揭示了氨氧化古菌在不同利用年限的茶园土壤中的数量及多样性，为茶园土壤合理施肥服务。主要结果如下：
　　 1.pH为5时，茶园土壤净硝化率分别为0.308，0.272，0.356；当pH下降至4时，净硝化率却随之上升，为1.365，1.146，1.659；而当pH下降至3左右，净硝化率为所选取样品中最高，分别为1.929，1.558，1.341。这一异常结果与茶园土壤中的高强度施肥密切相关。
　　 2.对土样中AOA的amoA基因进行定量PCR，发现其在茶园土壤中的数量很大，尤以50年茶园土壤中AOA的数量最多，分别为2.05×107 copies·g-1，2.84×107copies·g-1，3.04×107 copies·g-1，居于第二位的是10年茶园土壤，分别为1.5×107copies·g-1，9.4×106 copies·g-1，9.8×106 copies·g-1，新种茶园土壤中AOA数量最少，但也均位于106数量级之上，分别为3.5×106 copies·g-1，2.7×106 copies·g-1，5.6×106copies·g-1。而AOB却因数量太少无法扩增，说明在茶园土壤中AOA的数量居于主导地位，并且不同利用年限的茶园土壤均表现出了强烈的硝化作用。这进一步证实了氨氧化古菌在土壤生态系统中是比AOB丰富度更大的且非常重要的氨氧化生物。
　　 3.选取了18个酶切剖面不同的样本测序，对amoA基因序列进行系统发育树构建。结合已知的M-TRFLP数据，我们发现，GU396251、GU396242、GU1396250、GU396241、GU396243是茶园土壤中AOA的优势种群，对于茶园土壤中的高硝化活性起着不可低估的重要作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

1硝化作用及微生物的研究进展(文献综述)

1.1土壤的硝化作用

1.1.1硝化作用的影响因素

1.1.2氨氧化微生物的种类及机制

1.2酸性土壤中的硝化作用

1.3茶园土壤中的硝化作用

1.4硝化细菌检测技术的研究进展

1.4.1分子生物学方法的应用

1.4.2免疫检测技术的应用

2实验材料与方法

2.1研究区概况

2.2土壤样品采集与处理

2.2.1土壤采集

2.2.2土壤样品的处理

2.3土壤样品的基本性质

2.3.1 pH，全氮的测定

2.3.2有机质等的测定

2.4土壤净硝化势的测定

2.5克隆文库的建立

2.5.1土壤样品DNA的提取

2.5.2 amoA基因片段的PCR扩增

2.5.3 amoA基因片段的克隆及测序

2.5.4系统发育树的构建

2.5.5向Genbank提交序列数据

3结果与讨论

3.1土壤基本理化性质

3.2茶园土壤pH值的变化

3.3土壤净硝化作用的变化

3.3.1不同pH对土壤净硝化作用的影响

3.3.2小结

3.4氨氧化古菌的丰富度的测定及多样性的分析

3.4.1土壤样品DNA的提取

3.4.2 AOA的amoA基因的PCR扩增

3.4.3 PCR产物的克隆及阳性克隆的鉴定

3.4.4重组子的酶切分析

3.4.5测序结果

3.4.6序列号的获取

3.4.7氨氧化古菌多样性的分析

3.4.8小结与讨论

参考文献