PLGA/纤维蛋白凝胶复合支架的制备及其用于软骨再生的研究

摘要

本文构建了纤维蛋白凝胶填充聚乳酸-乙醇酸(PLGA)支架用于关节软骨缺损的修复。采用明胶微球为致孔剂制备了平均孔径为350μm、孔隙率为87％的PLGA多孔支架。利用纤维蛋白凝胶的溶胶-凝胶过程，将纤维蛋白凝胶负载于PLGA多孔支架中构建复合体系。纤维蛋白凝胶能够均匀地填充PLGA支架的孔隙，在PLGA大孔中充满了直径200nm左右的纳米纤维填充物。体外软骨细胞共培养表明，虽然填充支架与PLGA支架在细胞增殖上无明显差别，但填充支架能够更好地维持软骨细胞的正常表型，促进细胞分泌粘多糖(GAGs)。
　　 评价了PLGA支架在37℃的磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)和兔关节软骨缺损处的降解性能。体外降解表明PLGA分子量半衰期为6周；24周后，PLGA的分子量降低到初始分子量的7％。植入体内的PLGA表现出更快的降解速率，12周后，分子量降低到初始分子量的4％。
　　 将异体骨髓间充质干细胞(BMSCs)负载于PLGA/纤维蛋白凝胶复合支架中，植入新西兰大白兔关节软骨全层缺损（直径3mm，深度4mm）处，以PLGA/BMSCs作为对照组。12周后取样，切片后进行苏木素-伊红染色(H-E)、过碘酸雪夫碱(PAS)染色GAGs、Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果表明实验组新生软骨表面连续，软骨层厚度甚至稍厚于正常关节软骨厚度；新生软骨组织和周围正常软骨组织连接较好；软骨层中细胞密度接近正常关节软骨，深层细胞呈现明显陷窝状；宿主接近的新生组织中富含GAGs和Ⅱ型胶原，但着色稍弱于周围正常软骨，缺损中心区域有较少的GAGs、未见Ⅱ型胶原沉积。对照组主要生成纤维组织，新生组织PAS和Ⅱ型胶原染色的着色强度明显弱于实验组。表明纤维蛋白凝胶填充的PLGA多孔支架比单一的PLGA支架有更好的软骨修复能力。
　　 采用CM-DiI标记异体BMSCs，负载于PLGA/纤维蛋白凝胶中植入兔关节软骨缺损处。小动物成像系统发现即使在植入12周后依然可见红色荧光位于缺损区域，冰冻切片结果也表明植入的BMSCs在12周后依然存活。
　　 为了进一步提高关节软骨的修复效果，将转化生长因子-βi(TGF-βi)负载于该复合支架中，构建PLGA/纤维蛋白凝胶/BMSCs/TGF-β1复合体系，将该复合体系植入到兔关节软骨全层缺损（直径4mm，深度4mm），以PLGA/纤维蛋白凝胶/BMSCs为对照组。12周后，实验组新生组织填充整个缺损区域，软骨层厚度接近正常软骨，软骨下骨和潮线恢复良好，软骨层和软骨下骨连接一致；整个新生软骨层中富含GAGs和Ⅱ型胶原，其中的细胞为典型软骨细胞的表型，细胞密度接近正常软骨。不合TGF-βi的对照组，宿主附近的新生组织中富含GAGs和Ⅱ型胶原，着色稍弱于周围正常软骨，缺损中心主要生成纤维组织；荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)的结果也证实了实验组软骨特异性基因的表达显著高于对照组。说明负载TGF-βi的复合支架能更好地促进关节软骨缺损的修复。
　　 为了克服生长因子易失活价格昂贵等缺点，将基因治疗引入PLGA/纤维蛋白凝胶复合支架。采用季铵化壳聚糖(TMC)作为质粒DNA(pDNA)的载体，通过TMC和pDNA之间的静电作用，将pDNA压缩形成纳米复合粒子。在2D培养系统中，TMC/pDNA对BMSCs的转染效率为9％。采用能够表达TGF-βi的质粒DNA(pDNA-TGF-β1)转染BMSCs能够在10天内持续表达TGF-βi。将构建的PLGA/纤维蛋白凝胶/BMSCs/(TMC/pDNA-TGF-βi)植入兔关节软骨全层缺损处（直径4mm，深度4mm），以无pDNA或无BMSCs为对照组。实验组2周和4周取样，western blotting和qRT-PCR检测到异种的TGF-βi的表达，但随时间延长TGF-βi的量减少.实验组12周取样发现缺损处填满半透明的组织，表面平整，与周围组织的界限已不明显。组织学染色发现，新生组织厚度接近正常软骨，与宿主组织连接较好，较难找出缺损位置；整个新生软骨层中PAS和Ⅱ型胶原着色均匀，且和正常软骨差别；细胞为典型软骨细胞的表型，有明显的软骨陷窝出现；软骨下骨和潮线恢复良好，软骨层和软骨下骨连接一致；qRT-PCR的结果也证实了软骨特异性基因的表达显著上调。不含pDNA组，宿主附近的新生组织中富含GAGs和Ⅱ型胶原，着色稍弱于周围正常软骨，但缺损中心仍有1mm左右的区域未修复；未加入BMSCs组，则主要生成了纤维组织，基本未见软骨样组织。负载功能DNA能够原位转染BMSCs、表达TGF-βi，能促进BMSCs向软骨细胞分化及软骨特异性基质的合成，促进缺损关节软骨的修复。

目录

文摘

英文文摘

致谢

1 文献综述

1.1 关节软骨的结构和功能

1.2 当前关节软骨病变的修复方法

1.3 组织工程和再生医学用于关节软骨的再生

1.3.1 软骨组织工程中的种子细胞

1.3.2 组织工程支架

1.3.3 生长因子

1.3.4 组织工程软骨修复中基因治疗

1.3.5 生物力学刺激

1.4 课题的提出

2 PLGA/纤维蛋白凝胶复合支架构建

2.1 实验部分

2.1.1 原材料和试剂

2.1.2 PLGA多孔支架的制各及表征

2.1.3 纤维蛋白凝胶和PLGA多孔支架复合材料的制备与表征

2.1.4 软骨细胞与复合支架共培养

2.2 明胶微球的形貌

2.3 PLGA多孔支架的物化性能

2.3.1 PLGA的基本性能

2.3.2 PLGA多孔支架的形貌

2.3.3 PLGA多孔支架的体外降解

2.4 纤维蛋白原凝胶/PLGA复合支架物化性能

2.4.1 纤维蛋白原凝胶/PLGA复合支架的形貌

2.4.2 PLGA/纤维蛋白原凝胶复合支架的力学性能

2.4.3 纤维蛋白原凝胶在复合支架中的降解性能

2.5 复合支架对软骨细胞的相容性研究

2.5.1 软骨细胞的形态学研究

2.5.2 软骨细胞在复合支架中增殖的研究

2.5.3 软骨细胞在复合支架中GAGs的分泌

2.6 本章结论

3 复合支架负载BMSCS修复兔关节软骨的研究

3.1 实验部分

3.1.1 原料和试剂

3.1.2 BMSCs的分离与培养

3.1.3 复合支架体内移植实验及常规切片染色评价

3.1.4 PLGA支架在体内降解研究

3.1.5 异体BMSCs在兔关节处存活实验研究

3.1.6 负载TGF-β1的复合支架的构建与TGF-β1的释放

3.1.7 负载TGF-β1的复合支架在体内修复关节软骨的研究

3.1.8 荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测体内基因的表达

3.2 复合支架修复3MM兔关节软骨缺损的研究

3.3 PLGA多孔支架的体内降解

3.4 异体BMSCS在兔关节处存活实验研究

3.5 负载于复合支架中的TGF-B1体外释放行为

3.6 复合支架结合TGF-B1修复4MM软骨缺损

3.6.1 12周取样组织学评价

3.6.2 12周取样基因水平的评价

3.7 本章结论

4 复合支架结合基因治疗修复兔关节软骨缺损

4.1 实验部分

4.1.1 主要原料与试剂

4.1.2 N-三甲基壳聚糖TMC)的制各与表征

4.1.3 TMC/DNA复合物微粒的制备与表征

4.1.4 TMC/DNA复合粒子与BMSCs体外共培养

4.1.5 复合支架的制备与表征

4.1.6 复合支架体内移植实验及常规切片染色评价

4.1.7 Western blotting(WB)检测体内TGF-β1的表达

4.1.8 RT-PCR检测基因的表达

4.2 TMC的化学结构

4.3 TMC/DNA复合粒子的形貌

4.4 TMC/DNA复合粒子与BMSCS相互作用

4.4.1 TMC/DNA复合粒子对BMSCs的细胞毒性

4.4.2 TMC/pDNA-eGFP复合粒子对BMSCs的转染研究

4.4.3 TMC/pDNA-TGF-β1复合粒子对BMSCs的转染后TGF-β1的表达

4.5 复合支架的形貌及力学性能

4.5.1 复合支架形貌

4.5.2 复合支架力学性能

4.5.3 复合支架中DNA的释放

4.5.4 BMSCs在复合支架中原位转染的研究

4.6 复合支架对兔关节软骨全层缺损修复的研究

4.6.1 复合支架在体内TGF-β1的表达

4.6.2 12周取样大体观察以及组织学结采

4.6.3 样品中粘多糖的分泌

4.6.4 Ⅱ型胶原的分泌

4.6.5 样品中RNA的分泌

4.7 组织学评分结果

4.8 本章结论

全文总结

不足与展望

参考文献

作者简介

攻读博士学位论文期间科研成果：