基质VEGF-C和C-C趋化因子受体7介导前列腺癌淋巴结转移研究

摘要

研究背景：
　　 肿瘤转移是恶性肿瘤致死的主要原因。近年来研究显示，淋巴系统对肿瘤向局部淋巴结和远端器官转移具有直接作用。本课题组前期研究结果提示，前列腺癌首先通过淋巴管向局部淋巴结扩散，而这一过程又为后续向远端器官转移提供了细胞富集库。淋巴内皮细胞生长因子-C(VEGF-C)是淋巴道新生及由此引起肿瘤细胞向淋巴结迁移的主要因素。趋化因子受体-配体间相互作用有助于肿瘤细胞实现向特定器官转移。
　　 研究目的：
　　 本研究首要目标是构建一个由基质细胞来源VEGF-C诱导肿瘤淋巴道新生，引起前列腺癌淋巴结转移的动物模型。第二个目标是论证CCR7/CCL21趋化因子受体-配体作用轴是引导前列腺癌淋巴结转移的关键分子信号之一。
　　 实验方法：
　　 1.为探索基质细胞来源VEGF-C在前列腺癌扩散中的作用，我们构建了一个由人类前列腺癌细胞LAPC-9与小鼠基质细胞株NIH3T3以等比混合组成的皮下移植瘤动物模型。利用慢病毒载体在LAPC-9细胞标记编码Renilla luciferase(RL)的基因；在NIH3T3细胞中标记编码人类VEGF-C(hVEGF-C)的基因，用含有标记GFP基因的慢病毒载体作为对照。LAPC-9/3T3混合移植瘤被植入重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠皮下。用检测RL信号的CCD光学影像技术，在体和离体追踪移植瘤生长与扩散情况。原位移植瘤和肿瘤转移灶中趋化因子与受体的表达水平，分别由实时定量RT-PCR法、免疫组织化学法及western bl0t法进行分析。
　　 2.为了进一步分析由上述动物模型所得结果，我们采用两株人类前列腺癌细胞株CWR22Rvl(CWR)和LNCaP作为体外替代模型。并用慢病毒载体CMV-CCR7-IRES-GFP标记上述细胞株。用含有编码CCL21基因的腺病毒载体(Ad-CCL21)感染A549细胞株以生产含有CCL21的条件培养基，用Ad-firefly腺病毒载体作为对照。用趋化跨膜迁移实验(chem0taxis assay)检测上述表达CCR7的细胞株与条件培养基之间的相互作用。用实时定量RT-PCR和western bl0t法检测相关基因和蛋白产物的表达情况。
　　 实验结果：
　　 1.LAPC-9/3T3-hVEGF-C移植瘤的边缘呈现大量新生淋巴管，并因此促进被标记的肿瘤细胞向局部淋巴结和肺进行转移(该组出现淋巴转移概率为66.67％)。与之相异，GFP对照组移植瘤均未见明显转移。通过检测两组样本中一系列与转移相关基因表达水平，我们发现hVEGFR-3、hMMP9、CCR7和CCL21淋巴结转移灶表达增加，CXCR4在肺转移灶中表达上调。另外，将淋巴结中分理出的部分转移灶重新移植入SCID小鼠皮下进行扩增，并检测相关基因表达水平。与对应原位移植瘤相比，扩增后肿瘤的CCR7基因表达增加11.62倍（P=0.0007），而CCL21基因表达增加11.37倍(P=0.001)。免疫组织化学实验检测进一步证实了上述结果。此外，分别从淋巴转移病灶和原位移植瘤分离制备单细胞悬液，前者在体外响应CCL21条件培养基发生趋化迁移的能力较后者明显增强(P=0.000009)。
　　 2.经基因修饰表达CCR7的CWR和LNCaP细胞株响应CCL21条件培养基进行趋化迁移的能力增强，并且这一现象可被抗-CCL21单克隆抗体拮抗。CCL21条件培养基刺激CWR/CCR7+细胞早期，其作用机制可能与激活促进存活的PI3K/Akt信号通路及NF-kB转录原件相关。
　　 结论：
　　 上述结果提示，基质细胞来源的VEGF-C能引起肿瘤边缘功能性淋巴管新生，为前列腺癌转移提供途径。CCR7/CCL21作用在前列腺癌细胞上调，为肿瘤细胞经淋巴系统向局部淋巴结定向迁移提供趋化吸引信号。前列腺癌细胞在淋巴结的富集后经体内循环系统向远处转移与CXCR4受体上调有关。