海洋生物毛蚶活性肽的研究

摘要

海洋生物所具有的物种多样性构成了新药开发的巨大潜在资源。活性肽是海洋生物活性物质中的一类重要化合物。本论文研究了海洋生物毛蚶天然活性肽的分离纯化、指纹图谱、抗肿瘤活性与毛蚶酶解活性肽的分离纯化和抗肿瘤、抗氧化活性。 本论文由两部分组成。 第一部分利用正交设计实验，确定了毛蚶总蛋白提取物的最佳提取工艺为:加入两倍体积的磷酸盐缓冲液（pH8.0，10mmol/L）并匀浆3min。采用超滤分段和分级盐析方法，对总蛋白提取物进行分级分离。同时用MTT法测定各组分对八株肿瘤细胞（A549，BEL-7404，CNE，Hela，PC-3，HL-60，KB，P-388）的细胞毒活性，其中70～100％饱和度盐析组分对Hela、HL-60和KB的IC50值分别为6μg/mL,24μg/mL和76μg/mL。 通过对70～100％饱和度盐析组分进行指纹图谱的初步研究，确定了HPLC指纹图谱的条件为柱温30℃，检测波长280nm，流速1.0 mL/min，流动相A为80％乙腈（含0.1％ TFA），流动相B为0.1％ TFA超纯水溶液，梯度洗脱，35 min内，A相由50％线性升至70％，同时B相由50％线性降至30％;并对连续十批样品进行了指纹图谱分析。 利用离子交换与凝胶过滤柱层析等方法，从70～100％饱和度盐析组分中纯化得到五个产物:G-2、 G-3、 G-4-2、G-6-1和G-6-2。体外抗肿瘤活性测定结果表明:G-4-2对Hela、HL-60和KB细胞的IC50值分别为22.9μg/mL、46.1μg/mL及57.7μg/mL，G-3对HL-60细胞的IC50值为123.2μg/mL，G-6-1对Hela细胞的IC50值为56.23μg/mL。 SDS-PAGE实验证明， G-4-2、G-3、G-6-1、G-6-2和G-2均达到电泳纯。经RP-HPLC检测，G-3和G-4-2的纯度均大于96％。G-2、G-3、 G-4-2、G-6-1和G-6-2的分子量分别为14，665.1Da、8，250.4 Da、15，970.8 Da、24，051.6 Da及20，099.8 Da;等电点分别为7.0、6.6、6.1、5.6和53。此外，尚测定了G-3和G-4-2的氨基酸含量;由苯酚-硫酸法初步测定G-3和G-6-2为糖肽类物质。 论文第二部分通过正交设计试验，以水解度(DH)为依据，研究了中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对毛蚶的最佳酶解工艺。根据三种蛋白酶的最佳条件对海洋生物毛蚶进行酶解，发现碱性蛋白酶的水解度始终高于其它两种蛋白酶。 凝胶过滤层析结果表明:木瓜蛋白酶酶解得到的肽组分大多分布在分子量较大的部分，碱性蛋白酶酶解产物中低分子量肽含量较多。采用离子色谱法进行氨基酸分析发现三种酶解产物肽含量顺序为:碱性蛋白酶水解产物＞木瓜蛋白酶水解产物＞中性蛋白酶水解产物。上述结果显示:碱性蛋白酶对毛蚶蛋白的酶解效果较好。 研究蛋白酶酶解产物的抗氧化活性发现，三种酶解产物对DPPH自由基和H2O2的清除作用及还原力均呈量效关系，其中碱性蛋白酶水解产物对DPPH自由基和H2O2的清除作用最佳;三种酶解产物的还原力相似。 根据蛋白酶的酶解效果和抗氧化活性研究结果，确定碱性蛋白酶为制备毛蚶抗氧化活性肽的最适蛋白酶。通过CM Sepharose FF离子交换层析分离得到三个组分:A-A、A-B和A-C。其中组分A-B对DPPH自由基清除效果最好，浓度为5mg/mL时清除率为67.64％。用Sephadex G-25柱分离该组分，得到11个洗脱峰，其中g峰(A-Bg)和h(A-Bh)峰的清除率为32.89％（2mg/mL）和28.08％(2 mg/mL)。RP-HPLC C8柱层析结果表明，h峰为纯品;g峰可进一步分得两峰，其中首峰A-Bg1的清除率强于A-Bg2。 经过质谱分析和氨基酸N端测序，确定A-Bg1氨基酸序列为FCCC，A-Bh为WWW。

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致谢

摘要

第一部分 毛蚶天然活性肽的分离纯化与抗肿瘤活性研究

1 绪论

1．1 前言

1．2 海洋生物活性肽的研究进展

1．3 展望

1．4 立题依据

2 毛蚶多肽的提取、分离及抗肿瘤活性研究

2．1 材料与方法

2．2 结果与讨论

2．3 小结

3 海洋生物毛蚶多肽的纯度鉴定和性质测定

3．1 材料与方法

3．2 结果与讨论

3．3 小结

4 海洋生物毛蚶多肽的指纹图谱

4．1 材料与方法

4．2 结果与讨论

4．3 小结

第二部分 毛蚶酶解活性肽的分离纯化及抗肿瘤抗氧化活性的初步研究

5 绪论

5．1 前言

5．2 蛋白酶在生物活性肽制备中的应用

5．3 自由基与生物活性肽的抗氧化作用

5．4 立题依据

6 海洋生物毛蚶最佳蛋白酶的筛选

6．1 材料与方法

6．2 结果与讨论

6．3 小结

7 抗氧化活性肽的分离纯化和鉴定

7．1 材料与方法

7．2 结果与讨论

7．3 小结

8 结论

全文总结

参考文献

作者简历及在读期间所取得的科研成果