基于cpDNA单倍型和SSR分析的银杏群体遗传结构和谱系地理学研究

摘要

银杏（Ginkgo biloba L．）是第三纪孑遗植物，世界著名的“活化石”。关于银杏的冰期避难所、群体遗传多样性和遗传结构一直以来都是植物学家们感兴趣的话题。在前期研究的基础上，本研究通过单亲遗传的cpDNA基因间隔区序列变异以及双亲遗传的核基因微卫星位点(SSR)分析，对国内外银杏群体进行了深入的谱系地理学和群体遗传学研究，探讨了中国银杏的群体遗传结构和遗传多样性，在银杏避难所群体生存现状的基础上，提出了相应的保护策略。主要研究结果如下：
　　 1．cpDNA trnK基因，trnS-trnG基因间隔区和atpH-atpI基因间隔区序列分析
　　 在对33个群体430个个体的分析中，cpDNA trnK基因，trnS-trnG和atpH-atpI基因间隔区序列共检测到15种单倍型。银杏物种水平的单倍型多态性（h）为0.352，核苷酸多态性（π）为0.580x10-3，遗传多样性水平总体较低。西南地区和东部TM群体的遗传多样性较高。分子差异分析显示遗传变异主要存在群体内(55.50％)，但群体间已经出现相当程度的遗传分化(44.50％)。
　　 贝叶斯分析和单倍型分布揭示了中国的西南地区和东部地区形成两个不同的谱系，表明中国西南地区和中东部地区的银杏形成了2个显著进化单元，是银杏的冰期避难所。
　　 2．SSR标记的筛选
　　 采用磁珠富集法开发了11对银杏微卫星引物。11个位点在40个个体中共得到100个等位基因，杂合度的期望值（HE）和观察值(Ho)的平均值分别为0.795和0.484，多态信息位点(PIC)平均值为0.752，表明这些位点具有较高的多态性。上述结果为全面深入研究银杏群体遗传和谱系地理打下了坚实的基础。
　　 3．SSR分析
　　 首次运用14对SSR标记分析了银杏的群体遗传结构和遗传多样性（33个银杏群体共980个个体），结果揭示出中国中部群体的遗传多样性较高，可能是种质多样和群体的混杂造成的。银杏群体的遗传变异主要存在于群体内(88.10％)，群体间的遗传分化Fst=0.119。Structure分析揭示的结果与cpDNA相同，即西南地区群体和东部地区群体呈现出两个独立进化的路线，东部的天目山、西南的WC群体和JF群体具有较高的遗传多样性和稀有等位基因丰富度，而中部群体则表现出东、西群体基因库混合的状态。
　　 结合cpDNA数据，我们进一步确定了中国西南地区的贵州务川和重庆金佛山以及东部浙江西天目山地区为银杏的冰期避难所。韩国栽培群体表现出与中国西南群体和中部群体较高的相似性，日本栽培群体则与中国中东部地区相似。欧美古老的银杏大树来自于日本东京群体，欧美其余个体与中国、韩国和日本群体之间均出现了显著的遗传分化。
　　 4．银杏的进化历史和传播历史
　　 基于BEAST运算得到这两个谱系最近的共同祖先距今约1.9(1.2-2.8)百万年，当时正处于第三纪末第四纪初，因此为古老的避难所。在距今约70万年前的间冰期，中国中东部银杏群体经历了快速的扩张。基于SSR分析的稀有等位基因丰富度表明，离避难所越远，群体的稀有等位基因丰富度逐渐下降，说明冰期后银杏从就近的避难所开始向外扩张。中国中部地区则成了两个避难所群体基因库的混合区域。
　　 银杏有着非常悠久的栽培历史，SSR分析揭示出银杏各栽培群体的来源不同，遗传多样性低的群体其来源比较单一。韩国与日本群体的遗传多样性均较高，说明其是从中国的多个地方多次引入的。欧美的银杏遗传多样性程度都很低，并且与其他群体出现了明显的遗传分化。银杏花粉流与种子流的比值为4，显著低于其它风媒传粉且繁育系统为异交的植物，表明人类活动对银杏基因流尤其是种子流的影响非常大，也可能是人类活动促进了银杏群体间的基因交流，使其度过灾难存活至今。
　　 5保护策略
　　 通过对避难所银杏群体和栽培群体的遗传结构和遗传多样性比较及两个避难所群体间遗传多样性的分析，提出以下保护策略：(1)应在中国西南地区，尤其是在贵州务川(WC)建立银杏保护区，对务川县山江村的银杏古树应该重点保护；(2)浙江西天目山的银杏群体具有较高的遗传多样性，在迁地保护上具有优先权。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 谱系地理学简介

1.1.1 谱系地理学的提出及内容

1.1.2 谱系地理学的相关理论

1.2 银杏的生物学特性及研究现状

1.2.1 银杏的生物学特性

1.2.2 银杏的研究现状

1.2.3 中国有无野生银杏群体的争论

1.3 存在的问题

1.4 本研究的目的和意义

2 银杏野外调查及材料采集

2.1 调查时间和采集方法

2.2 银杏取样地生境

2.2.1 甘肃徽县

2.2.2 河南新县

2.2.3 安徽金寨

2.2.4 广东韶关

2.2.5 湖南壶瓶山

2.2.6 湖北神农架

2.2.7 江苏宝华山

2.2.8 日本

3 cpDNA单倍型分析

3.1 材料

3.2 实验方法

3.2.1 DNA提取

3.2.2 引物筛选

3.2.3 PCR扩增及测序

3.2.4 数据分析

3.3 实验结果

3.3.1 序列信息与单倍型分布特点

3.3.2 遗传多样性和遗传结构分析

3.3.3 群体遗传分化分析

3.3.4 单倍型谱系分析

3.3.5 群体历史分析

3.4 讨论

3.4.1 遗传多样性及遗传结构

3.4.2 冰期避难所推测

3.4.3 群体历史分析

3.4.4 人类活动对银杏群体遗传结构的影响

4 微卫星标记的筛选

4.1 实验方法

4.1.1 检测已发表银杏微卫星引物的有效性

4.1.2 对己发表的近缘物种的引物进行筛选

4.1.3 用已有的EST序列进行微卫星引物筛选

4.1.4 磁珠富集法获取银杏微卫星序列

4.1.5 数据判读与分析

4.2 实验结果

4.2.1 已有引物的有效性

4.2.2 松科引物扩增结果

4.2.3 EST-SSR扩增结果

4.2.4 磁珠富集法实验结果

4.3 数据分析及相关讨论

4.3.1 遗传多样性分析

4.3.2 位点间连锁不平衡检测和哈温平衡检测

4.3.3 微卫星引物筛选应注意的问题

5 基于SSR的银杏群体遗传结构分析

5.1 材料

5.2 实验方法

5.2.1 DNA提取

5.2.2 引物筛选

5.2.3 数据判读及分析

5.3 实验结果

5.3.1 银杏群体遗传多样性

5.3.2 群体遗传结构分析

5.3.3 瓶颈效应检测

5.3.4 空间遗传结构分析

5.3.5 群体间遗传分化

5.3.6 群体间基因流

5.4 讨论

5.4.1 遗传多样性和群体遗传结构

5.4.2 冰期避难所

5.4.3 冰期后扩张路线

5.4.4 国内外栽培群体来源及人为活动干扰

6 避难所银杏群体的生存现状及保护策略

6.1 贵州务川的银杏群体

6.2 浙江西天目山的银杏群体

6.2.1 cpDNA分析

6.2.2 SSR分析

6.3 避难所银杏群体的保护现状

6.3.1 避难所之间银杏群体的遗传多样性比较

6.3.2 银杏保护策略的制定

6.3.3 天目山自然保护区的保护现状

7 总结与展望

7.1 总结

7.2 展望

参考文献

发表和拟发表的论文

致谢