过量表达OsiICK4对水稻种子发育及植株生长的影响

摘要

细胞分裂及其周而复始的循环是植物(包括其它生物)生长发育的基本动力。正常的细胞周期，即从上一次分裂结束到下一次分裂结束为止的活动过程，是由一种高度保守的分子机制调控。细胞周期依赖激酶抑制因子(InhibitorsofCDK，ICKs)即是这种分子调控机制中重要的一环。在水稻上，根据基因组序列预测的ICK基因共有6个，除了Oryza；ICK1(克隆自粳稻)和OsiICK6(克隆自籼稻)之外，其它ICK基因的功能尚未得到验证。本研究选择其中一个编码产物最短的OsiICK4进行分子特征和过表达分析，并进而观察它对水稻植株生长发育的影响。所用的启动子为本实验室自己克隆的水稻33kDa分泌蛋白启动子(33kDasecretary protein promoter，33SP)，所用的遗传转化方法为农杆菌介导的基因转化法。主要研究结果和结论如下：
　　 利用RT-PCR法克隆得到的OsiICK4序列全长为261bp，编码85个氨基酸。MEME分析显示OsiICK4C-末端含有2个保守区域，为典型的植物ICKs的CDK和CYC结合功能域，进一步的分析表明，OsiICK4还含有一个推定的核定位信号。但与水稻其它ICKs不同的是，OsiICK4没有PEST功能域和CDK磷酸化位点；
　　 亚细胞定位结果表明OsiICK4是核蛋白，利用酵母双杂交分析证实它能与OsiCDKA和OsiCYCD蛋白相互作用，但不能与OsiCDKB蛋白互作；
　　 遗传转化共获得23个过量表达独立转化体，对其中4个转化体的T2代纯系的半定量RT-PCR分析显示，OsiICK4的表达量都显著高于对照。进一步的表型分析表明，所获得的T2代纯系比对照植株平均矮20％左右。根据显微切片数据发现其原因是转基因植株茎杆细胞的长度明显增加，但是其相应的细胞数量却大为减少；
　　 OsiICK4基因的过量表达还导致叶片异常反卷。同样的由显微切片观察发现，这种叶片异常反卷是由于OsiICK4基因的过量表达引起叶片的运动细胞数量减少，但其体积明显增大所至。上述结果表明，过量表达OsiICK4能有效抑制细胞分裂，导致细胞数量减少，但以细胞体积增大作为补偿。
　　 OsiICK4基因的过量表达还导致水稻花粉育性降低和种子发育异常，以至终产量大幅减少。花粉育性检测和细胞核DAPI染色结果显示，过量表达植株的花粉大多数染色浅或不染色，并停留在单核期，因此，植株高度不育性，即便产生少量种子，但胚乳充实不完全，部分胚消亡。上述结果表明，OsiICK4基因在花粉的形成和胚及胚乳发育过程中发挥十分重要的作用。
　　 综上所述，我们的实验结果证明OsiICK4基因对水稻的营养生长和生殖发育均起关键作用，包括茎叶细胞分裂、伸长和花粉发育，种子的形成。由于胚乳占了水稻种子的最大部分，因此，在水稻种子发育过程中通过人为调控OsiICK4基因的表达，使其促进胚乳的发育，即可藉此提高粮食产量。

目录

文摘

英文文摘

致谢

中英文缩略表

1.前言

1.1 细胞周期

1.2 细胞周期调控机制及主要的调控因子

1.2.1 细胞周期蛋白(cyclins)

1.2.2 细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)

1.2.3 细胞周期蛋白依赖激酶抑制基因(inhibtors of cyclin-dependent kinases，ICKs)

1.2.4 其他细胞周期蛋白调控因子

1.2.5 细胞周期的转换

1.3 拟南芥ICKs研究进展

1.4 水稻ICKs的研究进展

1.5 酵母双杂交技术

1.6 亚细胞定位技术

1.7 本研究的目的和意义

2.材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 水稻材料

2.1.2 质粒载体与菌株

2.1.3 培养基

2.1.4 酶、试剂盒、PCR引物、药品及仪器

2.2 实验方法

2.2.1 植物基因组DNA、RNA提取

2.2.2 目的基因的分离及中间载体的构建

2.2.3 OsilCK4基因过表达载体构建

2.2.4 亚细胞定位

2.2.5 酵母双杂交分析

2.2.6 水稻遗传转化

2.2.7 植株再生与初步鉴定

2.2.8 半定量RT-PCR分析

2.2.9 株高、叶形及石蜡切片观察

2.2.10 产量性状观察

2.2.11 花粉活性观察

3.结果与分析

3.1 OsilCK4基因的特征表述

3.1.1 OsilCK4基因的分离

3.1.2 OsilCK4基因的核苷酸序列及氨基酸序列分析

3.1.3 亚细胞定位

3.1.4 OsilCK4与CDKs、cyclins的互作分析

3.2 OsilCK4基因过量表达对水稻植株形态及种子发育的影响

3.2.1 推定的转基因植株的获得

3.2.2 转基因植株的鉴定及半定量RT-PCR分析

3.2.3 OsilCK4基因过量表达影响植株茎的生长

3.2.4 OsilCK4基因过量表达导致植株叶片反卷

3.2.5 OsilCK4基因过量表达对水稻产量的影响

3.2.6 OsilCK4基因过量表达影响花粉的完整性和活性

4.讨论

参考文献

作者简历

附录 主要培养基及试剂配方