AccRoyalisin重组表达及产物抑菌活性研究

摘要

蜂王浆(royaljelly)是蜜蜂工蜂咽下腺、上颚腺和脑后腺等腺体(俗称王浆腺)分泌蜂王浆的乳状物质,是1-3龄工蜂幼虫及蜂王的终生食料,它含有丰富的生物活性成分,多种生理活性和营养保健功能。中华蜜蜂(Apisceranacerana)是原产于我国的土著具蜂种,具有明显优于西方蜜蜂(Apismellifera)的抗病性。近期研究表明,中华蜜蜂抗病性优于西方蜜蜂以及蜂王浆不易变质的特性都与抗菌肽royalisin有关。
　　 此前,本实验室已完成了对中华蜜蜂抗菌肽Acc-Royalisin的原核表达及表达产物抑菌活性初步研究。本研究重点进行了原核表达放大试验,产物规模化分离纯化。在此基础上,进行了原核表达产物抑菌谱、代表菌最低抑菌浓度、抑菌稳定性、抑菌机理的系统研究。
　　 同时,进行了Acc-Royalisin基因真核表达载体构建。首先,以含Acc-Royalisin基因的载体为模板,采用引入编码6xHis4-EKDNA序列的5-P引物,和编码Acc-Royalisin基因的3-P引物,进行目的基因PCR扩增。然后将引入6xHis+EKDNA序列的目的基因连结到pGEX-4T-2载体的GST基因3'端。最后,以此插入GST-6xHis-EK-AccRoyalisin序列的载体pGEX-4T-2-AccRoyalisin为模板,采用根据此重组序列和酵母表达载体pPIC9K的相应酶切位点SnabI和NotI设计的5-P和3-P引物,进行目的基因PCR扩增,得到长度约850bp的DNA片段。将纯化的PCR产物和酵母表达载体pPIC9K分别用SnabI和NotI双酶切,酶切产物再分别作电泳检测和割胶回收,连接,转化DH5α感受态细胞,培养筛选出重组AccRoyalisin-pPIC9K阳性克隆。将AccRoyalisin-pPIC9K线性化,电击转化毕彻酵母GS115。抽提酵母基因组DNA,进行PCR鉴定,筛选出含目的基因的重组子。
　　 对重组酵母行诱导表达,表达产物SDS-PAGE电泳分析。结果表明,表达产物在30kDa处具有特异性条带。以GST多克隆抗体为一抗进一步作Westernblot检测,结果检测到目的蛋白印迹,说明AccRoyalisin基因在酵母菌中也已表达成功。所表达的多肽经纯化获得单一蛋白。抑菌活性检测结果表明,重组酵母表达的AccRoyalisin对革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌和黄色微球菌具有抑制活性。

目录

文摘

英文文摘

第一章 抗菌肽研究概况

1.昆虫抗菌肽研究概况

1.1 昆虫抗菌肽的分布及特点

1.2 昆虫抗菌肽的分类

1.3 蜜蜂及蜂王浆来源的抗菌肽

2.抗菌肽的特性及分类

2.1 抗菌肽的特性

2.2 抗菌肽的分类

3.抗菌肽的作用机理

3.1 孔洞学说

3.2 形成细胞膜电势依赖性通道(voltage-dependent channel)

3.3 “地毯”模型

3.4 抑制细胞呼吸作用

3.5 抑制细胞外膜蛋白的合成

3.6 抑制细胞壁的形成

4.抗菌肽的应用前景

4.1 抗菌肽在食品行业中的应用

4.2 抗菌肽在医药行业的应用

4.3 抗菌肽农业及畜牧业中的应用

第二章 本研究的目的、意义及技术路线

1.本研究目的和意义

2.研究内容

3.技术路线

第三章 AccRoyalisin原核表达及表达产物纯化

1.材料和试剂

2.方法

2.1 重组AccRoyalisin的诱导表达

2.2 重组表达产物AccRoyalisin的纯化

2.3 重组表达产物AccRoyalisin定量测定

3.结果

3.1 重组AccRoyalisin的诱导表达

3.2 AccRoyalisin重组表达产物的纯化

3.3 AccRoyalisin重组表达产物产量测定

4.讨论

第四章 原核表达产物AccRoyalisin的抑菌活性研究

1.材料和试剂

2.方法

2.1 抑菌谱检测

2.2 热稳定性分析

2.3 酶标仪法检测最低抑制浓度(MIC)

2.4 透射电镜观察样品制备

3.结果

3.1 抑菌谱分析

3.2 抑菌活性分析

3.3 热稳定性

3.4 最低抑制浓度MIC测定

3.5 抑菌机理研究

4.讨论

第五章 原核表达产物多克隆抗体制备

1.研究材料

2.方法

2.1 抗原准备

2.2 多克隆抗体制备

2.3 多克隆抗体效价测定

2.4 蜂王浆中抗菌肽的定性测定

3.结果

3.1 多克隆抗体效价测定

3.2 蜂王浆中抗菌肽定性测定

4.讨论

第六章 AccRoyalisin真核表达系统构建

1 材料和试剂

2.方法

2.1 引物设计及PCR扩增目的片段

2.2 重组表达质粒pPIC9k的构建

3.结果

3.1 目的片段的获得

3.2 目的片段序列测定

3.3 重组表达质粒pPIC9k的构建及阳性酵母重组子的鉴定

4.讨论

第七章 AccRoyalisin真核表达及产物抑菌活性

1.材料和试剂

2.方法

2.1 阳性克隆诱导表达

2.2 重组表达产物AccRoyalisin的纯化

2.3 重组表达产物AccRoyalisin Western blot分析

2.4 抑菌谱研究

2.5 酶标仪法测最低抑制浓度(MIC)

3.结果

3.1 表达产物SDS-PAGE分析

3.2 重组表达产物AccRoyalisin的纯化及SDS-PAGE分析

3.3 重组表达产物AccRoyalisin的Western blot分析

3.4 抑菌谱研究

3.5 最低抑制(MIC)浓度测定

4.讨论

第八章 主要结论及展望

1.主要创新点

2.本研究的主要结果

3.今后研究方向

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间论文及专利发表情况