缺氧对大鼠脑微血管内皮细胞PI3K/Akt信号通路及神经血管单元的影响

摘要

第一部分缺氧后大鼠脑微血管内皮细胞PI3K/Akt通路的表达变化
　　 [目的]目前,相比于成年大脑退行性疾病所致认知功能障碍而言,发育期大脑认知功能障碍的发病机制则不尽相同。从目前资料来看,大多数研究侧重于认知发展中的社会生物因素,基于发育期大脑特点深入探讨认知功能障碍分子机制特别是信号转导通路方面的研究则较少。PI3K/Akt信号通路是一个经典抗凋亡、促存活的信号转导途径。近年来已有研究发现PI3K/Akt通路与学习认知有关。在全脑慢性缺血模型中,发现血管内皮细胞Akt和PTEN的表达与学习记忆损伤程度密切相关,提示血管内皮细胞Akt和PTEN通过调控大脑微环境而影响认知学习能力。
　　 本研究将建立大鼠脑微血管内皮细胞的体外缺氧模型,首先观察缺氧后脑微血管内皮细胞PI3K/Akt信号通路的变化,其次观察PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对脑微血管内皮细胞的影响,以期更好的阐明PI3K/Akt通路对脑微血管内皮细胞的影响及其在大脑缺氧性损伤时的作用。
　　 [方法]
　　 2周龄SD大鼠4只,取脑皮质培养脑微血管内皮细胞,建立细胞体外缺氧模型。微血管内皮细胞的分组:对照组、缺氧组、干预组(LY294002干预)、共同干预组。采用MTT法测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;制备各组微血管内皮细胞爬片,收集各组细胞的蛋白样品,利用免疫荧光技术和westernblot技术检测PI3K/Akt信号通路相关通路因子的表达,包括Akt、P-Akt、P-PTEN及P-FOXO1,观察和检测缺氧对大鼠脑微血管内皮细胞PI3K/Akt通路的影响及LY294002干预的作用。
　　 [结果]
　　 成功培养出脑微血管内皮细胞,并成功建立细胞缺氧模型。细胞置于缺氧箱6h时,细胞已发生反应,但活力及凋亡情况尚好,缺氧及LY294002同时干预的CMECs,其活力及凋亡情况较正常组及单纯缺氧组有明显差异。PI3K/Akt抑制剂LY294002对CMECs的抑制作用随LY294002的浓度和作用时间的增加而增大。免疫荧光技术及westernblot技术检测缺氧及LY294002干预后的PI3K/Akt通路变化,发现缺氧组P-Akt表达增高,LY294002干预组P-Akt表达减少;P-PTEN在缺氧后即刻表达变化不明显,LY294002干预组表达增高;P-FOXO1缺氧后其表达增高,LY294002干预组则表达降低。
　　 [结论]
　　 缺氧可以激活脑微血管内皮细胞PI3K/Akt通路,使通路相关因子的表达发生改变,在这一过程中LY294002可以抑制缺氧引起的通路活化;PI3K/Akt通路抑制剂LY294002可以抑制脑微血管内皮细胞的增殖和细胞活力,并且抑制率与LY294002的浓度和作用时间成正相关。
　　 第二部分不同微血管内皮细胞条件培养液对神经元的影响
　　 [目的]脑内神经元及突触传递及其可塑性是认知的关键,有研究表明,阿尔茨海默病患者认知功能的进行性下降与脑内神经元大量凋亡密切相关。认知过程主要是神经元通过突触间的信息传递和处理而发生,但神经元所赖以生存的内环境是其发挥作用的基础。神经血管单元(neurovascularunit,NVU)是由多种细胞组成的动态微环境结构,神经元及脑微血管内皮细胞(Cerebralmicrovascularendothelialcells,CMECs)是其关键组成细胞,有效的调节CMECs的功能状态就可以影响其他细胞尤其神经元的形态及功能变化,从而调整NVU的微环境平衡。因此认识相关部位NVU的微环境平衡也被认为是认知和发展的关键环节。新生儿脑缺氧、缺血是导致儿童认知功能障碍的最常见原因之一。迄今,CMECs对脑缺氧损伤后大脑认知相关部位NVU微环境的调控机制及其认知、认知功能障碍发生的关系还不明确。
　　 本研究将采用不同的脑微血管内皮细胞条件培养液(即不同的NVU微环境)去干预正常及缺氧神经元,观察其对神经元的影响,并进一步阐述PI3K/Akt通路对神经血管单元的作用。
　　 [方法]
　　 孕16天SD大鼠1只,取胎鼠脑皮质培养脑神经元,同样建立体外缺氧模型。收集第一部分中对照组、缺氧组、干预组、共同干预组的脑微血管细胞条件培养液,对正常和缺氧的神经元进行干预。采用MTT。法检测干预后各组神经元活力情况,采用Hoechst33258染色观察神经元凋亡情况。
　　 [结果]成功培养出脑神经元细胞。不同的CMECs条件培养液对神经元有不同的影响,MTT法及Hoechst33258染色的结果提示正常CMECs培养液对缺氧损伤的神经元有促存活抗凋亡的作用,缺氧CMECs条件培养液则进一步加重神经元的损伤,抑制PI3K/Akt通路对神经元的活力有一定的抑制作用。
　　 [结论]
　　 正常微血管内皮细胞条件培养液对神经元的活性有促进作用,缺氧或LX294002干预的内皮细胞条件培养液会加重神经元的损伤;神经血管单元微环境的改变可以对神经元的活性造成一定影响,微血管内皮细胞可以通过分泌一些生物活性因子及通过PI3K/Akt通路来调控神经元活性。

目录

文摘

英文文摘

致谢

论文说明:主要缩略词

引言

第一部分

1 前言

2 主要仪器设备和试剂

3 实验材料和方法

4 结果

5 讨论

6 结论

第二部分

1 前言

2 主要仪器设备和试剂

3 实验材料和方法

4 结果

5 讨论

6 结论

全文总结

参考文献

综述:神经血管单元的细胞组成

作者简历及在读期间所取得的科研成果