耐辐射球菌DNA损伤响应基因ddrI的研究

摘要

耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)是世界上最耐辐射的物种之一，对各种DNA损伤介质具有超强的抗性，已成为研究基因组完整性和稳定性的一种理想模式生物。本实验室的研究结果显示，一个被注释为CRP/FNR家族的基因ddrⅠ(基因编号为dr0997)，在DNA受损时被显著诱导表达，可能贡献于耐辐射球菌的极端抗性。因此，我们重点围绕该基因进行了研究。
　　 1.分别构建了dr0997及其同源基因dr1646的基因缺失突变株，并发现突变株相对于野生株，生长情况出现了明显的延滞。
　　 2.分析了△DR0997突变株对DNA损伤因子的抗性。结果表明：dr0997和dr1646对UV和氧化损伤抗性的贡献都不大。而△DR0997突变株对γ-射线辐照处理很敏感，表明该基因可能与电离辐射造成的双链断裂修复有关。
　　 3.用DNA微阵列技术分析了突变株相对于野生株的转录谱变化。本研究覆盖了3033个基因，占整个基因组的95.26％。DR0997的缺失导致28个基因的转录水平明显上调，另外79个基因明显下调，这些基因很多涉及NADPH、乙酰辅酶A合成酶等的转录合成，表明dr0997可能参与调控了相关途径。
　　 4.表达并纯化了DR0997重组蛋白。通过测序，我们证实对该基因在Genebank的ORF是错误的，其实际长度为612 bp，我们以新序列为标准克隆了dr0997基因，并最终成功在体外表达并纯化了DR0997重组蛋白。
　　 综上所述，耐辐射球菌的DR0997基因对其极端抗性很重要。它是一个具有特异性DNA结合活性的代谢调节基因，主要通过调控与细菌抗氧化和DNA修复相关的途径起作用。它与重要蛋白PprⅠ和RecA的相互关系正在探索之中。

目录

文摘

英文文摘

致谢

主要缩略语

1 文献综述

1.1 极端微生物

1.1.1 耐辐射球菌的研究概况

1.1.2 耐辐射球菌的形态、结构特性

1.1.3 耐辐射球菌的基因组

1.1.4 耐辐射球菌损伤反应修复机制

1.1.5 小结

1.2 双组分(组氨酸蛋白激酶和反应调节蛋白)信号转导系统

1.2.1 双组分信号转导系统的发现

1.2.2 研究双组分(组氨酸蛋白激酶和反应调节蛋白)系统的意义

1.3 CRP家族

1.3.1 CRP家族的发现

1.3.2 CRP结构

1.3.3 CRP作用机制

1.3.4 研究CRP的意义

1.4 本文的立论依据和研究意义

2 耐辐射球菌ddrⅠ及相关基因缺失突变株的构建与特性分析

2.1 基因缺失突变株的构建

2.1.1 菌株和试剂

2.1.2 仪器与设备

2.1.3 菌株培养

2.1.4 基因缺失突变菌株的构建方法

2.2 突变体特性分析

2.2.1 材料和试剂

2.2.2 主要仪器

2.2.3 实验方法

2.3 结果和分析

2.3.1 各种突变菌株的构建

2.3.2 ddrⅠ基因缺失前后生长情况比较

2.3.3 突变株△DR0997对各种逆境的反应

2.3.4 △DR0997、△DR1646突变菌株对电离辐射很敏感

2.4 讨论

2.5 小结

3 耐辐射球菌△DR0997突变株转录谱分析

3.1 材料与试剂

3.1.1 耐辐射球菌基因芯片的制备

3.1.2 RNA抽提、逆转录、芯片杂交及Q-RT-PCR所用试剂

3.2 实验方法

3.2.1 耐辐射球菌总RNA的分离

3.2.2 芯片探针的制备

3.2.3 芯片预杂交和杂交

3.2.4 芯片扫描及数据分析

3.3 结果与分析

3.4 小结

4 耐辐射球菌DR0997蛋白的体外表达与纯化

4.1 材料、试剂与设备

4.1.1 菌株与质粒

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要仪器与设备

4.2 实验方法

4.2.1 大肠杆菌感受态制备

4.2.2 dr0997基因的克隆

4.2.3 DR0997蛋白表达质粒的构建

4.2.4 DR0997蛋白的表达

4.3 结果与分析

4.3.1 ddrⅠ基因ORF的实际长度为612 bp

4.3.2 DdrⅠ蛋白体外表达

4.3.3 ddrⅠ基因及其蛋白产物DdrⅠ的生物信息学分析

4.4 小结

5 总结与展望

参考文献

作者简历

教育经历

硕士期间主要研究成果