麋鹿Ⅰ类,Ⅱ类MHC位点的分离及其适应性进化潜力评估

摘要

麋鹿是一个经历过严重近交，但成功从最初18只奠基个体发展至3千多头的物种。麋鹿起源于中国，由于战乱天灾，19世纪末，麋鹿种群在中国本土灭绝。现存在世界各地的麋鹿都是19世纪末保存在英国乌邦寺18头麋鹿的后代。20世纪80年代，中国从英国重引入了77头麋鹿放养在北京南海子麋鹿苑(38头)和江苏大丰(39头)。麋鹿遂在中国迅速发展壮大。麋鹿种群从灭绝边缘幸存下来并逐渐膨胀，成为保护极危物种的成功典范。
　　 主要组织相容性复合体(Maior Histocompatibility Complex，MHC)是脊椎动物特有的多基因家族，能编码种类丰富的膜蛋白，具有呈递抗原、启动免疫应答的功能，是动物适应性免疫系统的重要组成部分。本研究以麋鹿北京种群和大丰种群共220只个体为研究对象，通过HURRAH方法分离MHCⅠ类、Ⅱ类基因并进行遗传变异分析，揭示了麋鹿MHC基因的遗传变异现状。主要的研究结果如下：
　　 1)建立了HURRAH分离MHC基因的方法。首先，基于通用引物(universal，U)合成生物素探针，对cDNA进行杂交(hybridization，H)分离序列，并通过带型复原(reconstitution，R)方法确认cDNA序列分离完整性!随后，通过分析(analysis，A)不同个体在基因组DNA水平的异源双链分子(heteroduplex，H)图谱，并选择复原(reconstitution，R)最简约和最复杂双链带型，以确保各座位基因组序列得以分离，并据此进一步判断座位数量。该方法简单，快速、高效，在哺乳动物中通用。
　　 2)HURRAH方法首先运用于Ⅱ类MHC基因的分离。我们共获得了10条全长cDNA序列(2条DRA，4条DRB，2条DQA和2条DQB)及其对应的10条基因组序列，并从中鉴定了9个Ⅱ类基因(DRA1、DRB1、DRB2、DRB3、DRB4、DQA1、DQA2、DQB1和DQB2)。序列分析表明，所有Ⅱ类cDNA序列都可以编码完整蛋白，符合经典基因的特征。
　　 3)北京和大丰两个群体的分子调查结果表明，9个Ⅱ类基因在抗原呈递区都是单态的，仅DRA在其胞质区呈现二态。由此，我们获得了2个不对称的Ⅱ类MHC多基因单倍型：DRA1*01～DRB1～DRB3～DQA1～DQB2和DRA1*02～DRB2～DRB4～DQA2～DQB1。Ⅱ类不对称单倍型暗示了麋鹿在经历严重的瓶颈效应后，丢失了更强大的Ⅱ类单倍型(包含9个Ⅱ类基因甚至更多)而固定了2个相对较弱的单倍型(各包含5个Ⅱ类基因)，潜在病原易感危机。
　　 4)HURRAH方法随后运用于Ⅰ类MHC基因的分离。我们获得了6条全长cDNA序列(F1、F12、G2、I7、AF和I8)和7条基因组序列(F1、F12、G2、I7，AF、I8和C1)，并成功地鉴定了7个Ⅰ类MHC基因(F1、F12、G2、I7、AF、I8和C1)。通过序列特征(包括终止密码子、经典基因保守氨基酸和GC含量)和系统进化分析，本研究将7个Ⅰ类基因分为经典基因(F1、F12、G2和I7)、非经典基因(AF)和Ⅰ类假基因(I8和C1)。
　　 5)北京和大丰两个种群的分子调查结果表明，4个经典的Ⅰ类MHC基因在抗原结合区都呈现出单态，而Ⅰ类非经典和假基因则呈现出不同程度的多态。在北京麋鹿种群中，AF和I8各有2条等位基因，C1则有4条等位基因。而在大丰麋鹿种群中，由于缺少AF*01和C1*03，AF、I8和C1基因分别是单态、二态和三态。该结果与大种群的多态经典Ⅰ类和寡态非经典Ⅰ类和假基因的多样性模式相反，为瓶颈种群的MHC平衡选择进化模型提供了证据，即在瓶颈动物种群中，平衡选择比遗传漂变更快地丢失MHC多样性，以便尽快体现具有重要功能的MHC等位基因！
　　 6)综合Ⅱ类和Ⅰ类MHC基因的分子检测结果，我们获得了9种Ⅱ类与Ⅰ类的连锁单倍型，但从经典抗原呈递功能来说，瓶颈后的麋鹿仅有两个MHC多基因单倍型：DRA1～DRB1～DRB3～DQA1～DQB2～F1～F12～G2～I7(H1)andH2：DRA1～DRB2～DRB4～DQA2～DQB1～F1～F12～G2～I7(H2)。因此，我们建议对圈养麋鹿制定科学的繁殖计划，尽量增加H1/H2杂合子在子代中的数量，尽可能地提高子代的抗病能力，加强麋鹿圈养种群的生存能力。