高密度糖基化聚丙烯微孔亲和膜的点击化学制备及其蛋白质分离研究

摘要

亲和膜色谱是将分离膜与亲和色谱相结合的新型分离技术，具有膜分离快速对流传质的特征，通过配基的选择可同时使之兼具生物分子的识别功能，可一步实现生物大分子的分离纯化。聚丙烯微孔膜具有稳定性好、膜孔易调及成本低廉等优点，是一类具有重要工业化应用潜力的高分子分离膜材料。糖类可与蛋白质发生特异性识别作用，且通过糖苷集簇效应实现对不同蛋白质的选择性识别。因此，将糖基固定于聚丙烯分离膜表面有望发展一种新型的亲和膜色谱，用于蛋白质的高纯度、高选择性及高效快速分离与提纯。
　　 文献报道的表面糖基化方法种类繁多，但所涉及的化学反应效率普遍偏低，造成糖基密度低，不利于糖苷集簇效应的形成，从而降低糖基与蛋白质问的选择性及结合强度。发展一种安全可靠、反应效率高的化学偶联技术是构建糖基化亲和膜的先决条件。点击化学反应具有反应效率高、立体专一性好等优点。将点击化学反应用于聚合物膜表面糖基化的构建，可方便制得高密度的糖基化层，形成“糖苷集簇效应”，提高糖基对蛋白质的识别性能及结合强度。
　　 本论文建立了多种糖基化方法，结合点击化学反应的高效性在聚丙烯微孔膜表面构建高密度糖基化层，具体研究工作从以下几个方面展开：
　　 1、以二苯甲酮(BP)为引发剂，采用紫外光辐照接枝聚合方法在聚丙烯微孔膜表面接枝丙烯酸，随后与2-氨基葡萄糖盐酸盐反应，制备葡萄糖糖基化的聚丙烯微孔亲和膜。优化糖基化反应条件可提高表面糖基密度，结果显示糖基化效率低于40％，糖基密度较低，不能有效形成糖苷集簇效应，致使对蛋白质的识别效果较差。
　　 2、为提高表面糖基密度促进糖基化亲和膜与蛋白质形成糖苷集簇效应，首先构建炔基修饰的聚丙烯微孔膜。采用Cu(Ⅰ)催化的叠氮/炔点击化学反应将叠氮糖固定于表面，构建高密度的葡萄糖糖基化聚丙烯微孔亲和膜，表面糖基密度可超过10μmol/cm2。蛋白质的特异性识别性能研究显示，当糖基密度超过0.2μmol/cm2时，膜表面可产生强烈的糖苷集簇效应，实现对凝集素ConA的特异性识别。然而点击化学反应生成的三唑环对蛋白质具有非特异性吸附能力。
　　 3、采用巯/炔点击化学反应将炔基修饰的聚丙烯微孔膜进行高密度糖基化修饰。通过蛋白质识别性能研究，证明此方法构建的葡萄糖糖基化聚丙烯微孔膜对ConA具有良好的识别能力。此外，巯/炔点击反应生成的硫醚键可以避免蛋白质的非特异性吸附。
　　 4、为避免羧基对蛋白质的非特异性吸附的影响，在表面直接构建炔基修饰层。首先合成甲基丙烯酸(三甲基硅基)丙炔醇酯(TMSPA)单体，借助等离子预处理技术，在紫外光辐照下进行TMSPA的表面接枝聚合。采用巯/炔点击反应在炔基修饰的聚丙烯微孔膜表面构建高密度糖基化层。由于巯基糖的空间位阻效应导致炔基难以进行双分子加成反应，致使点击反应效率最高约为55％。蛋白质特异性识别研究表明葡萄糖糖基化聚丙烯微孔膜对ConA具有良好的识别能力。通过动态吸附研究，初步实现葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜对ConA的选择性识别分离。
　　 5、将叠氮/炔点击化学反应构建的高密度葡萄糖糖基化聚丙烯微孔膜作为亲和分离膜，选择性动态吸附蛋白质。结果表明葡萄糖糖基化的亲和膜可选择性吸附ConA，其结合容量随糖基密度的增加而提高，吸附Con A的亲和膜可采用1 M的HAc进行洗脱，重复使用性好。