基于微电子阻抗技术实时监测细菌与细胞相互作用方法的建立和应用

摘要

病原体与宿主之间的相互作用是复杂、动态的过程,它反映了病原体的特性和宿主对于感染的反应能力。对病原体与宿主相互作用的机制研究能帮助我们更好地预防和控制感染性疾病。在过去二十年里,借助于细胞培养和动物模型,我们对病原体与宿主相互作用有了更进一步的了解,但是其内在的分子机制还需进一步深入研究。
　　 尽管研究者开发了很多方法来研究病原体与宿主的相互作用,但其中绝大部分方法都是静态的终点法实验。基于微电子阻抗技术的细胞监测系统可以无标记、动态地监测细胞对于外界刺激的反应。利用微电子阻抗原理,Roche公司开发了新一代的无标记xCELLigence细胞实时监测系统。该系统已经被广泛地应用于细胞学的研究。本研究中,我们将微电子阻抗技术应用于细菌与宿主相互作用的研究。细胞感染细菌特征图谱实时反映了细菌与宿主相互作用的整个过程。通过传统的终点法实验,我们验证了感染特征图谱的特异性和敏感性。结果显示,通过对感染特征图谱的分析能够为病原体与宿主相互作用的机制研究提供连续、数量化的信息。
　　 第一部分基于微电子阻抗技术实时监测沙门氏菌与宿主细胞的相互作用
　　 本部分研究中,我们基于微电子阻抗技术建立了一种新型、无标记、实时监测肠道上皮细胞和巨噬细胞对于沙门氏菌感染反应的方法。感染后宿主细胞形态及粘附能力的变化被实时记录并转化为数字信息。细胞感染沙门氏菌特征图谱与传统方法进行比较也显示出良好的相关性和敏感性。我们证明感染图谱中细胞指数(Cell Index)的变化与细菌粘附电极、细胞的增殖无关。免疫荧光、电镜观察到了感染过程中宿主细胞的形态变化,通过抑制微丝或微管蛋白的聚集说明感染特征图谱主要与细胞骨架形态变化相关。感染图谱也和沙门氏菌感染后细胞的死亡存在关联。通过本部分研究,我们认为基于微电子阻抗技术实时监测细菌与宿主相互作用的方法可以在更真实的生理状态下对感染后细胞的反应进行研究,体现了传统方法所不具有的优势。
　　 第二部分基于微电子阻抗技术实时监测细菌与宿主细胞相互作用模型的应用
　　 全基因组表达谱芯片技术已经广泛地应用于宿主对细菌感染反应的研究。本部分中,我们利用肠上皮细胞感染沙门氏菌特征图谱选取了4个时间点进行芯片实验。芯片数据表明大量涉及炎症和天然免疫的基因在感染过程中被激活。从芯片数据中,我们发现IL-10细胞因子家族中的一员,白介素24(IL-24)在沙门氏菌感染肠上皮细胞后mRNA水平显著上升。IL-24 mRNA上升的水平和感染细菌的MOI值呈现正相关性。MAPK和PI3K信号通路抑制剂能够显著抑制感染后IL-24mRNA水平的升高。用IL-24重组蛋白预处理细胞可以阻止沙门氏菌的穿入而对沙门氏菌粘附不造成影响。IL-24可以促进细胞粘蛋白(Mucins)的表达,显示其在保护上皮细胞免受细菌感染方面潜在的作用。病原体相关分子模式(PAMPs)可以激活哺乳动物免疫细胞产生吞噬,吞噬过程中细胞骨架发生重构。通过xCELLigence系统,我们对巨噬细胞吞噬热灭活沙门氏菌和LPS包被微球的过程进行了实时监测,发现该系统能成功捕捉到吞噬的信号。我们又将感染特征图谱应用与抗生素作用机理的研究。在感染的不同时间点加入不同类型的抗生素可以影响感染特征图谱,图谱的改变也反应了各种抗生素抑制细菌的特性。最后,我们对获得的多种细菌的感染图谱进行比较分析,发现各图谱之间存在的相似点和不同点,而这些图谱说代表的生物学意义还需更加深入的研究。
　　 本研究中开发的基于微电子技术、无标记的细菌与细胞相互作用实时监测系统为首次报道。结合日益发展的细胞学技术我们可以克服细胞微生物学研究领域中有效研究技术缺乏的瓶颈,对细菌与细胞相互作用机制有进一步的了解。