羟基磷灰石/丝素复合支架负载BMP-2的制备及其生物相容性研究

摘要

骨形态发生蛋白2(BMP-2)隶属于转录生长因子β(TGF-β)超家族，具有促进成骨细胞分化、诱导骨组织再生的能力，目前已广泛应用于骨组织工程研究之中。羟基磷灰石(HA)是天然骨组织的主要无机成分，具有骨诱导性，能够诱导新生骨的血管化，促进新骨的形成，且植入体内后不会引起炎症反应，常用作骨修复材料。丝素蛋白(SF)因其良好的生物相容性、降解性及独特的力学性能等，广泛用于生物医学领域。因此，本研究采用原核表达系统进行重组人的骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)的表达，获得了有生物活性的BMP2成熟肽。在此基础上将rhBMP-2与HA及SF复合，制备了负载有rhBMP-2的HA/SF复合支架，并通过体内外实验，研究该材料的生物相容性及对骨缺损修复的影响。本研究主要包括三部分内容：
　　 1、重组人的骨形态发生蛋白2的体外表达、纯化及复性
　　 通过逆转录PCR方法从人骨肉瘤MG-63细胞中获得rhBMP-2基因，克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建了表达质粒pET30a-rhBMP2。将该表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达，变性条件下利用Ni离子亲和层析(Ni-NTA)柱进一步纯化目的蛋白，4℃不同pH值条件下尿素梯度透析复性蛋白。将MG-63细胞与rhBMP-2共培养，检测蛋白活性。实验结果表明，Ni-NTA柱可以纯化rhBMP-2，产量为58 mg/L培养基(4.8 mg/g细胞湿重)。蛋白复性产率随复性液pH值增大而增加。当复性液pH值为6.0时产率仅为3.4％，而pH7.4条件下复性产率为42％，pH9.0条件下可达96％。细胞实验结果显示，与pH9.0条件下获得的rhBMP-2相比，pH7.4条件下复性的rhBMP-2蛋白活性更强，能够显著促进MG-63细胞的增殖与分化。这主要是由于pH7.4更接近于人体生理条件，可促进目的蛋白形成二聚体，因此获得活性更强目的蛋白。
　　 2、负载rhBMP-2的HA/SF复合支架的制备
　　 本研究通过化学沉淀法合成了HA粉末，将其与SF共混后通过冷冻干燥法制备了HA/SF支架。利用SEM、XRD、FT-IR以及TGA等方法对复合支架进行表征。通过浸渍法将rhBMP-2与HA/SF支架复合，并在体外研究复合支架对rhBMP-2的吸附及释放。结果表明，本研究制备的HA/SF支架具有多孔结构，孔径分布在200μm左右，孔间连通性较好。HA颗粒可在支架中均匀分布，无明显团聚现象。XRD及FT-IR分析表明SF在复合支架中是以β-折叠构象存在。蛋白的体外吸附及释放实验表明，可通过调节浸渍液中目的蛋白浓度来控制rhBMP-2在复合支架中的负载量，复合后的rhBMP-2可以在较长时间内从HA/SF复合支架中持续释放。
　　 3、负载rhBMP-2的HA/SF复合支架的生物相容性研究
　　 本研究利用MG-63细胞研究复合支架在体外对细胞粘附、增殖及分化的影响。构建大鼠的颅骨缺陷模型，将复合支架移植于缺损处，观察支架对骨缺损修复的影响。通过将复合支架植入大鼠大腿肌肉中，检测支架对异位骨形成的影响。体外实验结果显示，rhBMP-2的负载可促进细胞在支架上的粘附、增殖及分化。体内实验表明该复合支架可以促进新骨形成，也可诱导异位骨形成。
　　 综上所述，本研究在大肠杆菌中表达了rhBMP-2蛋白，并通过体外复性获得了具有较高生物活性的rhBMP-2蛋白。利用该重组蛋白与HA/SF支架复合，制备了新型的骨修复材料。体内外研究表明该材料具有良好的生物相容性，并可以促进新骨的形成，是一种潜在的骨修复材料。