DDT降解质粒pDOD及其对土壤中残留DDTs降解的生物强化

摘要

DDT作为一种高效有机氯农药(Organochlorine pesticides，OCPs)，在我国曾大量用于农田害虫防治与公共卫生方面，是一种典型的持久性有机污染物(Persistent organic pollutangts，POPs)。虽然我国自1983年开始逐步禁用，但因其化学结构稳定，不易降解，国内很多地区仍有不同程度的DDT残留检出，存在一定的生态风险。
　　 本文调查分析了浙江省某地DDT残留状况及其来源，在确定DDT降解菌Sphingobacterium sp.DDT-6降解功能位于质粒pDOD的基础上，通过gfp标记获得质粒pDOD-gfp，研究了pDOD在土壤中的转移及其对DDT降解的促进作用、质粒pDOD供体菌在DDT污染土壤中的生物强化作用，建立了一种基于质粒转移的土壤DDT降解生物强化技术途径。主要研究结果如下：
　　 (1)对浙江省某地进行了DDT残留调查，61个取样点土壤样品中DDT的检出率为100％，p，p'-DDT、p，p'-DDE、o，p'-DDT、p，p'-DDD残留量的平均值占DDT总量的百分比分别为：56.1％、34.4％、6.88％和2.41％。采用样品土壤中o，p'-DDT与p，p'-DDT比值Rs判断DDT污染的来源，结果显示该调查地区的残留DDT主要源于DDT禁用前的长期大量使用。
　　 (2)DDT降解细菌Sphingobacterium sp.DDT-6经质粒消除后失去降解能力，质粒消除的Sphingobacterium sp.DDT-6’经质粒回复后重新获得降解能力，由Sphingobacterium sp.DDT-6提取质粒并转入E.coli TGⅠ获得的转化子具有对DDT的降解力，证明DDT降解细菌Sphingobacterium sp.DDT-6降解功能位于质粒pDOD，其大小约为20kb。
　　 (3)Sphingobacterium sp.DDT-6、E.coli DH5α(pZP201-gfp)及E.coliHB101(pRK2013)三亲杂交经抗性检测、荧光标记、质粒检测和降解功能试验筛选获得Sphingobacterium sp.DDT-6(pDOD-gfp)，提取标记质粒pDOD-gfp转化E.coli TGⅠ和Klebsiella sp.Tz获得质粒供体菌E.coli TGⅠ(pDOD-gfp)和Klebsiella sp.TZ(pDOD-gfp)，以Sphingobacterium sp.DDT-6(pDOD-gfp)、E.coliTGⅠ(pDOD-gfp)、Klebsiella sp.TZ(pDOD-gfp)和质粒pDOD-gfp接种土壤可显著提高土壤中DDT的降解和降解菌数量。从接种pDOD-gfp处理120d土壤中分离到一株具荧光特性、含pDOD的DDT降解菌纤维单胞菌(Cellulomonas sp.)ZYG2，说明pDOD-gfp接种土壤后降解质粒转入土壤细菌、增加土壤中DDT降解菌数量，从而提高DDT降解速率。
　　 (4)以E.coli TGⅠ(pDOD-gfp)为质粒供体菌研究了温度、湿度和土壤性质对其强化DDT降解作用的影响，结果表明：20℃、30℃、40℃培养条件下120d的DDT降解率分别为63.2％、70.0％、61.6％；土壤含水量为田间最大持水量的40％、60％、80％的培养条件下120d DDT的降解率分别为60.7％、65.3％、54.4％；120d华家池潮土、萧山海涂土、嘉兴青紫泥和金华红壤培养DDT的降解率分别为65.0％、63.5％、61.6％、60.1％。30℃、土壤含水量为田间最大持水量的60％的华家池潮土培养是E.coli TGⅠ(pDOD-gfp)为质粒供体菌强化对DDT降解的适合条件。
　　 (5)以Sphingobacterium sp.DDT-6、Sphingobacterium sp.DDT-6(pDOD-gfp)、E.coli TGⅠ(pDOD-gfp)为质粒供体菌制备降解功能菌剂，于浙江省某地进行DDT污染土壤修复试验，210d后对照处理土壤中DDT的降解率为16.2％，Sphingobacterium sp.DDT-6、Sphingobacterium sp.DDT-6(pDOD-gfp)、E.coli TGⅠ(pDOD-gfp)处理土壤中DDT的降解速率大幅提高，降解率分别为46.5％、52.0％和50.7％。同期运用PCR-TGGE研究了修复过程中土壤微生物群落结构多样性的变化，主成分分析的数据显示，对照处理与喷施质粒供体菌Sphingobacterium sp.DDT-6、Sphingobacterium sp.DDT-6(pDOD-gfp)、E.coli TGⅠ(pDOD-gfp)处理土壤样品在成分分析坐标系上的坐标聚于一簇，说明质粒供体菌的喷施未明显改变土壤微生物群落结构，180d至210dSphingobacterium sp。DDT-6(pDOD-gfp)处理土壤样品TGGE电泳图显示3条条带比其他处理略亮，说明某些土壤微生物种群数量上有所增加。