基于超分子组装体的生物分子荧光检测方法研究

摘要

荧光传感器因其灵敏度高、不损坏样品、使用方便,在检测中的应用越来越广泛。本文将超分子作用应用到荧光传感器的连接部分,通过非共价作用将识别部分与报告部分连接起来,构建以生物分子荧光检测为目的的超分子组装体。采用非共价连接取代复杂的有机合成,不仅可有效拓展组装单元的范围,简化体系的制备和优化过程,而且可丰富基于组装与解助装的检测方法。研究由此采用不同组装单元通过不同非共价作用构建了一系列超分子组装体,探索了基于超分子组装体解组装特性和基于超分子组装体结构转变特性的多种生物分子荧光检测方法。
　　 1.本研究首先以1-芘甲醇的羟基为起始基团,通过环氧乙烷的阴离子聚合,制备得到具有良好水溶性的聚环氧乙烷修饰的的芘(PEO-Vy)两亲分子,拓展了疏水性芘荧光探针在水相检测中的应用范围。系统的紫外和荧光光谱研究结果显示,在两亲性PEO-Py中加入金纳米粒子,可通过疏水作用在金纳米粒子表面有效吸附PEO-Py两亲分子,通过能量共振转移实现荧光淬灭。加入巯基分子后,巯基分子与金更强的作用力可以取代两亲性聚合物,使荧光恢复。系统的定量化实验显示,这种荧光恢复过程可实现含巯基氨基酸半胱氨酸的高灵敏检测。其中金纳米粒子对芘荧光的淬灭程度会影响到检测灵敏度,在淬灭程度为20～30％时会达到最好的检测效果。半胱氨酸荧光法检出限可达到11.4 nM,并具有良好的选择性。两亲性聚合物对金纳米粒子良好的稳定作用赋予体系良好的稳定性,可以用于检测血清中全部巯基分子的含量,回收试验验证了体系具有良好的准确性和可靠性,具有潜在的临床应用价值。
　　 2.通过静电和疏水作用,构建了带负电的多糖肝素分子与带正电表面活性剂的复合组装体系,疏水内腔可以包埋荧光探针芘。荧光光谱实验结果显示,通过多糖肝素分子和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的静电复合作用,可以在单纯CTAB临界胶束浓度以下获得具有强芘荧光发射的超分子组装体。在该体系中加入与肝素有特异性作用的蛋白,可破坏肝素分子和CTAB组装体,释放疏水探针芘,显著降低芘荧光发射强度。系统的定量化实验显示,这种荧光降低过程可实现对与肝素有特异性作用的鱼精蛋白与TAT多肽的高选择性荧光检测。
　　 3.研究以AIE分子特殊的聚集诱导发光机制和核酸适配体的高选择性作用为依据,采用荷正电的聚集诱导发光(AIE)分子与荷负电的核酸适配体的静电组装,制备了具有AIE分子荧光发射能力的超分子组装体。圆二色谱研究显示,在该超分子组装体中加入汞离子,可诱导富含胸腺嘧啶的核酸适配体与汞离子作用,使核酸适体的构象发生改变,AIE探针分子聚集程度进一步增大,荧光强度增加。这种荧光增强过程可用于检测汞离子,检出限为0.22μM。进一步引入与汞离子有更强作用的巯基分子,可恢复核酸适配体的结构,降低AIE荧光强度。利用这一过程可实现巯基分子谷胱甘肽的检测,检出限达到0.15μM,并具有良好的选择性。利用AIE分子与核酸适配体超分子组装体结构的这种双转变过程,可实现对汞离子和巯基分子谷胱甘肽的双检测。
　　 4.研究进一步将超分子主客体组装特性应用到基于荧光纳米量子点的生物分子检测体系中。通过在量子点表面共价键合β-环糊精,将量子点的荧光性能与β-环糊精的识别作用结合起来,获得了具有主客体组装功能的水溶性量子点。荧光光谱实验显示,对硝基苯酚进入β-环糊精空腔内的超分子组装过程,可通过电子转移有效淬灭量子点荧光。通过系统对照试验,发现其淬灭机制是酚羟基与硝基协同作用的结果。将对硝基苯酚的羟基通过磷酸根保护起来的对硝基苯磷酸二钠不能达到对量子点荧光的有效淬灭。
　　 基于对硝基苯磷酸二钠与对硝基苯酚对量子点不同的淬灭效应,研究采用β-环糊精表面接枝的水溶性量子点与硝基苯磷酸二钠复合组装,成功构建了碱性磷酸酶活性的检测体系。在该体系中,普通的生物分子不会对量子点荧光产生影响,而当该组装体和以磷酸根为特异性底物的磷酸酶接触时,可诱导磷酸根转化为羟基,实现量子点荧光淬灭。该特异性荧光淬灭现象可实现对碱性磷酸酶活性的生物荧光检测,检出限可以达到10mU/mL。