棉籽含油量和脂肪酸含量近红外光谱模型的创建及QTL定位研究

摘要

棉花是关系国计民生的重要物资，是纺织工业的重要原料，在国民经济发展中起着重要的作用，国际国内需求量很大。棉籽富含油分和蛋白质等重要物资，已经成为主要油料来源之一，并作为动物饲料在世界范围内应用，其重要性仅次于棉纤维在纺织行业的应用。近年来纺织行业的需求增长促使棉花育种者在如何提高纤维产量和质量等方面作了很多工作。一些棉副产品（如食用油、饲料等）的广泛利用，也使育种者更加重视如何提高棉籽产品的品质。由于棉花遗传基础和遗传机制均很复杂，以致于传统的棉籽品质分析方法的发展较为缓慢。分子生物学和分子遗传学的发展，使得将控制棉花数量性状的复合遗传因素剖析成单一遗传因子这一技术成为可能，这样就可以通过跟踪相关的分子标记和数量性状位点，借助分子标记辅助选择筛选目标性状，棉籽质量性状如油分和脂肪酸含量都属于数量性状并可以通过数量遗传学方法进行研究。然而，在大规模的育种工作过程中，化学方法测定油分和脂肪酸的含量仅仅局限于少量样品，而且过程耗时费工、价格昂贵。因此，便宜、快速、破坏性小而且可以应用到大量样品测定方法更受育种工作者的青睐，近红外光谱分析技术就具有这些优点，且能保证测定的准确性。由于生长在母体植株上的种子品质性状会同时受到不同的遗传体系基因效应的影响，因此位于二倍体胚和母体植株核基因组上的QTL表达可能有所不同，很有必要加以进一步的研究。
　　 本研究主要进行了两方面的内容。一是创建稳健的棉籽油分、棕榈酸、油酸和亚油酸含量性状的近红外光谱模型和分析方法，将这一分析技术应用于棉籽内油分和脂肪酸（棕榈酸、油酸、亚油酸、肉豆蔻、棕榈油、硬脂酸、亚麻酸和二十碳烯烃）含量的测定;二是利用两个陆地棉亲本(MARCABUCAG8US-1-88×HS46)杂交得到的RIL群体、IF2群体和遗传连锁图谱对油分和脂肪酸含量进行QTL定位，同时研究QTL的胚加性效应、胚显性效应和母体植株加性效应。所获结果如下:
　　 1.棉籽近红外扫描光谱与其油分、棕榈酸、油酸和亚油酸等含量的化学测定结果具有高度相关性。利用改良偏最小二乘法创建了稳健、准确的分析模型，可以用于测定棉籽样品相关性状的快速测定。含油量的模型方程决定系数(0.996)、定标标准误差(0.197)、交叉验证标准误(0.233)、内部交叉检验决定系数值(0.995)和RPDc值(14.06)都达到了理想的效果，含油量的回归相关图中也可以看出预测该性状的准确度最高，外部检验决定系数为0.993，预测标准误为0.273，RPDv为11.495。其次是亚油酸，模型方程决定系数(0.991)、定标标准误差(0.220)、交叉验证标准误(0.387)、内部交叉检验决定系数值(0.974)和RPDc值(6.186)，其外部检验决定系数为0.963，预测标准误为0.470，RPDv为5.026。油酸也表现出很高的相关性，其决定系数(0.891)、定标标准误差(0.462)、交叉验证标准误(0.602)、内部交叉检验决定系数值(0.817)和RPDc值(2.329)，预测样品时，其外部检验决定系数为0.795,预测标准误为0.702，RPDv为1.999，而肉豆蔻酸的建模相关决定系数(0.778)、定标标准误差(0.049)、交叉验证标准误(0.054)、内部交叉检验决定系数值(0.738)和RPDc值(1.937)都较好。但是，棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸和二十碳烯酸的建模效果较差，决定系数分别为0.481、0.485、0.233和0.526，内部交叉检验决定系数分别为0.409、0.453、0.112和0.501，尽管定标标准误差(分别为0.027、0.129、0.041和0.012)和交叉检验标准误分别为0.029、0.133、0.044和0.013较低，但其RPDc分别为1.305、1.346、1.062和1.391太低。用模型预测肉豆蔻酸和棕榈酸，其准确性相对较差，外部检验决定系数分别为0.753和0.777，预测标准误分别为0.058和0.513，RPDv分别为1.724和1.724，预测能力不够可靠，需要作进一步的研究。由于RPDv能够近似解释RPDc，总油含量和亚油酸含量的方程建模效果较好，能够确保其准确性并应用于育种过程中的样品筛选。而肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸的方程只能应用于样品的粗略筛选，硬脂酸、棕榈酸和二十碳烯酸的应用还不够精确，需要作进一步的建模。
　　 2.利用亲本和IF2群体，对控制棉籽油分含量位点进行胚和母体植株两套遗传体系QTL定位。研究结果表明IF2群体基本里正态分布，能够进行数量性状定位。本试验共定位到4个与棉籽含油量相关的QTL位点，分别位于18和22号染色体上和11号连锁群上，其中qOC-18-1位于18号染色体上JESPR204(c18)和CIR099(c18)标记之间，距离是2.91cM;qOC-LG11位于11号连锁群上NAU979和NAU1162之间，距离第一个标记的距离是4.56cM; qOC-18-2位于18号染色体上NAU1184b和BNL3479(c18)之间，距离第一个标记的距离是11.50cM;qOC-22位于22号染色体上CIR253和JESPR65之间，距离第一个标记的距离是6.10cM。结果还发现，就油分含量而言，qOC-18-1和qOC-22胚加性效应、qOC-LG11和qOC-18-2胚显性效应都达到极显著水平，qOC-18-2和qOC-18-2的母体加性效应分别达到极显著水平(P＜0.01)和显著水平（P＜0.05）。在QTL效应值上,qOC-18-2具有最大的胚加性效应（aem=0.4572**），qOC-LG11有最大的胚显性效应，qOC-18-2则具有最大的母体加性效应（am=-0.307**），其次QOC-LG11。qOC-18-1和qOC-22的母体加性效应（分别为-0.0320和0.0112）则未达显著水平。由于胚和母体植株不同基因组QTL的遗传效应有所不同，qOC-18-1和qOC-LG11的负向胚加性效应会降低棉籽的油分含量，而qOC-18-2和qOC-22的正向胚加性效应可以增加含油量;qOC-LG11的负向胚显性效应会降低棉籽的含油量;qOC-LG11的母体加性效应则能够增加油分含量，而qOC-18-2的负向母体加性效应会降低棉籽的油分含量。
　　 3.在5号染色体和5个连锁群LG1、LG7、LG9、LG10和LG14上定位到6个和棉籽脂肪酸含量相关的QTL位点。在这些QTL位点中，qC16-0-5-15位于5号染色体上BNL3992(c5)和TMB1667标记之间，距离第一个标记的距离为15cM; qC16-0-LG14-1位于14号连锁群上，标记RAPD-G17-270和RAPD-G17-200之间，距离第一个标记1cM处，这两个位点都与棕榈酸含量有关。在油酸含量上定位到qC18-1-LG9-1一个位点，位于9号连锁群上标记RAPD-G4-580和RAPD-I11-380之间，距离第一个标记1cM处。亚油酸含量定位到了三个QTL位点，其中qC18-2-LG10-8位于10号连锁群上标记NAU500a和NAU5171a之间，距离第一个标记8cM处;qC18-2-LG1-21位于1号连锁群上标记NAU5498b和NAU3426之间，距离第一个标记25cM处;qC18-2-LG7-2位于7号连锁群上标记TMB179和TMC10之间，距离第一个标记2cM。除了qC18-1LG9-1和qC18-2-LG7-2两个QTL之外，其他与脂肪酸相关QTL位点的母体加性效应都达到极显著水平。qC16-0-5-15和qC18-2-LG1-21两个位点的胚显性效应达到极显著水平，而qC16-0-5-15、qC18-1-LG9-1、qC18-2-LG10-8、qC18-2-LG1-21和qC18-2-LG7-2的胚加性效应也达到极显著水平。在胚和母体植株两套不同遗传体系QTL的遗传效应上，qC16-0-5-15的负向母体加性效应（am）和胚显性效应（aem）会降低棕榈酸含量，而qC16-0-5-15的正向胚加性效应（aem）和qC16-0-LG14-1母体加性效应（am）能够增加棕榈酸的含量。qC18-1-LG9-1负向胚加性效应（aem）会降低棉籽油酸含量;而qC18-2-LG10-8和qC18-2-LG7-2的正向胚加性效应（aem）则能够增加棉花种子的亚油酸含量，qC18-2-LG10-8的负向母体加性效应（am）、qC18-2-LG1-21胚加性效应（aem）和qC18-2-LG7-2胚显性效应((aem))能够降低其含量。因此，二倍体胚以及二倍体母体植株基因组QTL的加性效应均会明显影响棉籽的脂肪酸含量，胚显性效应也起着很重要的作用。

目录

声明

论文说明

Dedication

Acknowledgements

Contents

List of Abbreviations

Abstract

摘要

1 General Introduction

1．1 Origin of cotton cultivation

1．2 Cotton growth cycle

1．3 Types of commercially cultivated cotton

1．4 World production of cotton

1．5 Uses of cotton

1．6 Cottonseed germplasm resources and variation

1．7 Progress in cottonseed breeding

1．8 The application of NIR spectroscopy to plant breeding

1．9 Objectives of the present study

2 Literature Review

2．1 Characteristics of seed quality Traits

2．2 Seed quality traits and inheritance in oilseed plants

2．3 Oil quality

2．4 Fatty acids

2．4．1 Classification of fatty acids

2．4．2 Fatty acids in cottonseed

2．4．3 The fatty acid biosynthetic pathway

2．4．4 The pathway to oil accumulation in seed

2．4．5 Nutritional and health implications of fatty acids

2．5 Chemical analysis of oil and fatty acid contents

2．6 Near infrared reflectance spectroscopy (NIRS) and its application

2．6．1 The origin and characteristics of NIRS

2．6．2 The theoretical basis of NIRS quantitative analysis

2．6．3 Using NIRS for measurement

2．6．4 NIRS instrumentation：spectrophotometers

2．6．5 Data analysis and calibration development

2．6．6 Population definition

2．6．7 Qualitative analysis

2．6．8 Development of a calibration model

2．6．9 Model Validation

2．6．10 Establishment of the workflow of NIR spectroscopy measurement and calibration

2．6．11 Advantages and limitations of NIR spectroscopy

2．6．12 Features of NIRS application to agricultural products

2．7 Genetics of cottonseed quality traits

2．7．1 Gene expression for quality traits in cottonseed

2．7．2 Genetic variability in cottonseed

2．7．3 Cotton fatty acid content and nutrition quality

2．7．4 Construction of genetic map

3 Materials and Methods

3．1 Experiment materials

3．2 Field experiments

3．3 Analysis of oil and fatty acid contents of samples

3．3．1 Sample preparation

3．3．2 Reference methods

3．3．3 NIRS determination of oil and fatty acid contents in cottonseed kernel

3．4 Linkage map for QTL mapping

3．5 Data analysis and QTL mapping software

3．6 Characteristics of upland cotton interspecific RIL linkage map

3．7 Likelihood analysis

3．8 Hypothesis Tests／permutation tests

3．9 Parameter Setting

3．10 QTL mapping data

3．11 QTL mapping

3．11．1 Mixed linear model-based composite interval mapping

4 Results

4．1 NIRS analysis of oil and fatty acid content in cottonseed

4．1．1 Variability for oil content and fatty acid composition

4．1．2 Selection of spectral pre-treatment method

4．1．3 Calibration

4．1．4 External validation

4．2 Analysis of QTL related to oil and fatty acid content in cottonseed kernel

4．2．1 Phenotypic analysis of oil content in the parents and IF2 populations

4．2．2 QTL analysis for oil and fatty acid contents

4．2．3 Genetic effects on QTL controlling cottonseed oil content

4．2．4 Genetic systems controlling fatty acids in cotton seed kernel

5 Discussions

5．1 Variability for oil content and fatty acid composition

5．2 NIRS analysis of samples

5．3 Analysis of QTL related to oil and fatty acid content in cottonseed kernel

5．3．1 Effects of genetic systems controlling oil and fatty acid contents in cottonseed

6 Conclusion and future recommendations

Refefences

8 List of publications