先天性甲状腺功能减低仔鼠心肌细胞缝隙连接蛋白43和45的表达变化

摘要

目的：
　　 甲状腺激素(TH)对许多器官的发育和分化起到关键性作用。先天性甲状腺功能减低症(先天性甲低)是儿科常见的内分泌代谢性疾病之一，是造成儿童智力障碍的重要原因之一。此外，该疾病还常伴发许多器官功能障碍。如伴发心脏疾病，包括异常胎心率、先天性心脏疾病、心脏传导阻滞、心律失常，甚至是心室功能受损。有研究报道左旋甲状腺激素的替代治疗可改善心律失常和心室功能，甚至能促进动脉导管关闭。
　　 先天性甲低患儿伴发心脏异常的发病机制目前尚不十分清楚。TH在细胞核内与其受体(TR)结合，作用于靶基因启动子的甲状腺激素反应元件(TREs)，在转录水平调节靶基因的表达。有些研究报道先天性甲低可影响心脏上某些基因的表达，然而甲低具体通过影响哪些基因导致心脏发育异常目前仍不明确。
　　 缝隙连接(GJ)是一种细胞间连接方式，是相邻细胞间物质和信息直接交换的膜通道结构。GJ由相邻胞膜上的一对连接子构成，每个连接子包含6个缝隙连接蛋白(Cx)亚单位，构成一个直径约1.5nm的亲水孔道.相邻细胞间通过GJ介导的连接通讯(GJIC)进行信息、能量和物质的交换，从而对细胞的新陈代谢、内环境稳定，以及细胞的增殖、分化和胚胎发育等生理过程起到重要的调控作用。Cx广泛存在于哺乳动物的心脏中，包括Cx43，Cx45和Cx40等。Cx43是Cx家族中数量最丰富的成员，占到总数的90～95％，也是哺乳动物心脏中最主要的Cx。这些Cx对心脏的正常发育和生理功能具有重要的作用。他们调解电冲动的传播速度，触发心肌细胞和协调动脉壁细胞同步收缩。关于TH增高是否会影响心肌细胞上Cx43的表达仍有较多争议。目前，先天性甲低情况下Cx43和Cx45的表达尚无相关的研究报道。
　　 在此，我们通过建立先天性甲低的小鼠模型，检测先天性甲低对心室肌细胞Cx43和Cx45表达的影响，以进一步了解TH对Cx表达的调节作用，为深入研究先天性甲低伴发心脏疾病的发病机制和保护干预措施等提供实验依据。
　　 方法：
　　 1.模型建立和分组
　　 清洁级健康成年C57BL/6J小鼠合笼交配后自行产子，按处理条件不同分甲低组和对照组。
　　 甲低组：合笼第10天开始给予母鼠含0.03％甲巯咪唑的饮用水，一直到仔鼠出生7天后。
　　 对照组：一直喂养清洁饮用水，其它实验控制因素同甲低组。
　　 在仔鼠出生1、7和14天麻醉后处死，生理盐水灌注，留取心室标本。
　　 2.Realtime-PCR检测(RT-PCR检测)
　　 采用RT-PCR检测Cx43和Cx45的mRNA水平。采用AxyPrep总RNA小量制备试剂盒提取左心室组织总RNA，采用自行设计引物和Takara荧光PCR试剂盒进行PCR扩增，采用两步法检测Cx43和Cx45。热循环包括94℃预变性3分钟，94℃变性15秒和63℃复性35秒，共40个循环。扩增后，熔解曲线分析检测扩增子的正确性。目的基因mRNA水平采用△Ct表示，并应用△Ct进行组间比较，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参)，△Ct越小表明mRNA水平越高。设阴性对照。
　　 3.免疫组化
　　 新鲜心室组织予10％中性福尔马林固定和石蜡包埋，冠状连续系列切片，片厚4μm，采用“ChemMateTM和DakoEnVisonTM两步法”进行免疫组化检测。兔Cx43抗体购于美国LavisionNeo-Markers公司。兔Cx45抗体购于美国SantaCruzBiotechnologyInc。羊抗鼠或抗兔的IgG二抗购自碧云天生物技术公司(江苏)。
　　 免疫组化测量：每组6个标本，在相同光线背景下，在显微镜200倍视野下每个标本随机选择1个染色阳性区域(大小为461.944μm×345.328μm)，用Image-ProPlus5.0图像分析软件测量该区域的阳性表达积分光密度值(IntegratedOpticalDensity，IOD)，取平均值代表该组的蛋白颗粒密度，两组间均数比较用t检验。
　　 4.统计分析
　　 应用SPSS统计软件(10.0)进行数据统计分析。计数资料用均数±标准差，两组间差异应用t检验，多组组间差异应用单因素方差分析(One-WayANOVA)，继以LSD法两两比较.采用双侧性检测，P<0.05认为差异有显著性意义。
　　 结果：
　　 1.模型检验
　　 7天和14天日龄仔鼠处死前留血进行甲状腺激素水平检测，发现甲低组总T4和游离T4均较对照组降低，差异具有显著性意义(均P<0.001)。
　　 2.先天性甲低对Cx43和Cx45表达的影响
　　 对照组心室肌细胞Cx43△Ct出生后增加，生后7天达高峰，然后有所降低，提示出生后心肌细胞上Cx43mRNA水平较低，出生7天后开始升高。
　　 甲低组心室肌细胞Cx43△Ct出生后增加，但出生7天后仍在增加，意味着出生后心肌细胞上Cx43mRNA水平持续减低.与对照组比较，甲减组的Cx43△Ct在生后7和14天均明显升高(均P<0.001)，表示甲减组生后7和14天时Cx43mRNA水平明显减低。免疫组化显示两组的心室肌闰盘都存在丰富的Cx43蛋白。与对照组比较甲减组Cx43免疫阳性较低。
　　 两组的Cx45的△Ct出生后都呈下降趋势，各组的3个时间点间差异具有显著性意义(均P<0.001)，提示两组仔鼠出生后心肌细胞的Cx45mRNA水平呈增加趋势。
　　 与对照组比较，甲减组Cx45的△Ct稍高，但2组间的3个时间点比较，差异均无显著性意义(均P>0.05)，提示两组间Cx45mRNA水平无显著性差异。免疫组化显示两组的心室肌闰盘都存在丰富的Cx45蛋白，差异不明显。
　　 结论：
　　 1.先天性甲低仔鼠出生后心室肌细胞上Cx43表达持续下降，提示Cx43表达下降可能参与先天性甲低伴发心脏异常的病理生理过程。
　　 2.先天性甲低仔鼠在出生14天内，其心室肌细胞上Cx45表达无明显改变，提示在观察时间内，未发现Cx45表达与TH明显相关。