表面自组装TGF-β2抗体多层膜的新型人工晶状体研制及其抑制后发性白内障的研究

摘要

第一部分：表面自组装TGF-β2抗体多层膜的新型人工晶状体研制及其理化性质和分子生物学指标检测
　　 目的：
　　 评价应用静电层层自组装技术在疏水性丙烯酸酯人工晶状体(IOL)表面构建TGF-β2抗体多层膜的可行性，并检测表面自组装TGF-β2抗体多层膜的新型IOL的理化性质和分子生物学指标。
　　 方法：
　　 首先应用大气压下辉光放电等离子体预处理疏水性丙烯酸酯IOL，使其表面带上足量负电荷。然后应用静电层层自组装技术在IOL表面逐层沉积聚乙烯亚胺(PEI)、TGF-β2抗体(anti-TGF-β2)和聚赖氨酸(PLL)，从而在IOL表面构建PEI-(anti-TGF-β2/PLL)4-(anti-TGF-β2)多层膜。以石英晶体微天平(QCM)模拟并实时监测静电层层自组装过程，了解自组装膜的增长方式，自组装膜中每层沉积的TGF-β2抗体的平均质量、厚度和密度，以及自组装膜中TGF-β2抗体的免疫活性。以静态水接触角(WCA)检测新型IOL的亲水性。以X-射线光电子能谱分析(XPS)检测新型IOL表面化学元素组成变化。以场发射扫描电子显微镜(FESEM)和原子力显微镜(AFM)观察新型IOL的表面形态变化。应用SFDA关于IOL质量检测国家标准(YY-0290)对新型IOL进行光焦度、像质、光谱透过率和动态疲劳耐久性测试，以观察新型IOL的光学和力学特性有无改变。应用免疫荧光和激光扫描共焦显微镜观察新型IOL表面自组装膜的稳定性，以及自组装膜中TGF-β2抗体的免疫活性。
　　 结果：
　　 应用QCM模拟静电层层自组装过程，发现PEI、TGF-β2抗体和PLL可以线性增长的方式逐层沉积在IOL表面，自组装膜中每层沉积的TGF-β2抗体的平均质量、厚度和密度分别为(77.45±8.00)ng，(1.42±0.15)nm和(0.48±0.05)μg/cm2。QCM检查同时发现自组装膜中的TGF-β2抗体可以0.82:1的比例结合人重组TGF-β2因子，提示自组装膜中TGF-β2抗体保持良好的免疫活性，而且主要以侧面向上的方式分布。新型IOL的WCA为73.2°，较未处理IOL的WCA为92.1°明显降低，提示新型IOL的亲水性明显改善。XPS检查发现新型IOL表面化学成分中氧和氮元素含量明显升高，进一步证实TGF-β2抗体成功自组装到IOL表面。AFM检查发现新型IOL的表面粗糙度较未处理组IOL稍有增加，FESEM检查发现新型IOL表面形态光滑、平整，与未处理组IOL无差别。新型IOL的光焦度、像质、光谱透过率和动态疲劳耐久性测试均符合国家标准。免疫荧光和激光扫描共焦显微镜检查发现TGF-β2抗体多层膜可在新型IOL表面持续稳定存在至少3个月，自组装膜中TGF-β2抗体可以与外加TGF-β2因子结合，形成均匀、密集分布的免疫荧光沉积颗粒，提示自组装膜中TGF-β2抗体保持良好的免疫活性。
　　 结论：
　　 本研究应用大气压下辉光放电等离子体和静电层层自组装技术首次在IOL表面成功构建了TGF-β2抗体多层膜，TGF-β2抗体多层膜可以在IOL表面长期稳定存在，并保持良好的抗体免疫活性，而且对IOL表面形态、光学和力学特性无明显影响。
　　 第二部分：表面自组装TGF-β2抗体多层膜的新型人工晶状体抑制后发性白内障的研究
　　 目的：
　　 评价表面自组装TGF-β2抗体多层膜的新型IOL在体外和活体兔眼内预防后发性白内障的有效性和安全性。
　　 方法：
　　 将人晶状体上皮细胞(LECs)接种到表面自组装TGF-β2抗体多层膜的新型IOL和未处理IOL的后表面，LECs接种后6h、24h和48h，分别应用倒置相差显微镜观察LECs在实验组和对照组IOL表面的粘附和增殖情况。应用划痕实验观察并比较新型IOL和未处理IOL表面LECs在10ng/mlTGF-β2因子作用下的迁移情况。以α-SMA作为上皮-间质转分化标记蛋白，应用免疫荧光显微镜观察新型IOL和未处理IOL表面LECs在10ng/mlTGF-β2因子作用下的转分化情况。在活体兔眼内行晶状体超声乳化吸除并植入新型IOL(实验组)或未处理IOL(对照组)，制备兔眼后发性白内障模型，在术后1d、3d、1w、1mon、3mon，应用裂隙灯显微镜观察实验组和对照组兔眼前房闪辉、前方细胞和虹膜后粘连程度等前房炎症反应情况，并按照相应评价标准进行评分；术后1mon和3mon应用裂隙灯后照法拍摄后囊膜照片，以自行设计的PCO评价软件测量并比较实验组和对照组兔眼的后囊膜浑浊(PCO)严重程度。术后3mon处死兔，以Miyake-Apple后照法拍照进行PCO评分。摘取兔术眼眼球，取出IOL，应用免疫荧光联合激光扫描共焦显微镜检查了解新型IOL表面TGF-β2抗体多层膜的完整性。将晶状体囊膜以石蜡包埋切片后行HE染色，观察囊膜表面LEcs增殖和细胞外基质沉积情况；同时应用免疫组织化学法观察α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ在囊膜表面的表达情况。
　　 结果：
　　 表面自组装TGF-β2抗体多层膜的新型IOL可以短暂(细胞接种后6h内)抑制LECs的粘附，但最终对LECs的粘附和增殖无明显影响。划痕实验发现LECs在新型IOL表面的迁移能力较在未处理IOL表面明显下降。免疫荧光显微镜检查发现新型IOL表面LECs可以保持上皮细胞形态，而且α-SMA表达很少；而未处理IOL表面LECs呈纤维细胞形态，而且大量表达α-SMA。直接免疫荧光联合激光扫描共焦显微镜检查显示，IOL表面的TGF-β2抗体多层膜在活体兔眼内可以较长时间稳定存在。兔眼后发性白内障模型研究发现，除术后1w和1mon时实验组的前房闪辉和前房细胞较对照组有所减轻外，两组之间的术后前房炎症反应无明显差别。裂隙灯后照法与Miyake-Apple后照法PCO评分均显示对照组后囊膜PCO评分显著高于实验组。HE染色显示实验组囊膜较薄，表面LECs数量较对照组明显为少。免疫组织化学检查发现实验组囊膜表面α-SMA和CollagenⅠ表达量较对照组明显为少。
　　 结论：
　　 表面自组装TGF-β2抗体多层膜的新型IOL可以显著抑制晶状体后囊膜浑浊和纤维化，而且眼内使用的安全性良好。